運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試劑及其擴(kuò)增方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試劑及其擴(kuò)增方法，設(shè)計(jì)了五個(gè)引物組序列，5’-GAGGTCAGCGGTTCGA；5’-TGTGGCTGCGAACACACT；5’-GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAG；5’-GCGTCGTTGTGCAGT；5’-ACAGCAACCGGAGTGAAC。針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，本發(fā)明專利技術(shù)克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速低成本的檢測(cè)方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及病原體檢驗(yàn)技術(shù)，具體地說是運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)來檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的技術(shù)。
技術(shù)介紹
小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，屬于腸桿菌科耶爾森菌屬，是該菌屬三種致病性菌之一。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種腸道病原菌，流行病學(xué)特點(diǎn)與假結(jié)核耶爾森菌很相似，感染率高于假結(jié)核耶爾森菌。該菌可在低溫環(huán)境下生存，冰箱貯存食物是現(xiàn)代社會(huì)發(fā)生該菌感染的一個(gè)重要傳染源。因此能夠快速有效的檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對(duì)于與之相關(guān)的疾病防控具有重要的意義。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)方法有常規(guī)培養(yǎng)和生理生化反應(yīng)檢測(cè)等多種方法，與 傳統(tǒng)檢測(cè)手段相比，本專利技術(shù)很好的解決了目前大多數(shù)檢測(cè)技術(shù)手段的弊端。首先，無需任何復(fù)雜的儀器，只需要一臺(tái)簡(jiǎn)單的加熱器，如普通的水浴鍋或以電、電池為能源的加熱器，使得核酸診斷可以前所未有地用于現(xiàn)場(chǎng)診斷。其次，可以加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間。第三，易于操作者掌握，對(duì)反應(yīng)條件的要求相對(duì)寬松，使得以該技術(shù)為基礎(chǔ)的產(chǎn)品對(duì)操作人員的技能要求不高，這也為核酸試劑的普及創(chuàng)造了條件。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，本專利技術(shù)克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種運(yùn)用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速、便捷、低成本的試劑和檢測(cè)方法。本專利技術(shù)提供了更加快速和低成本通過等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的方法。本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(I)設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物用于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)；(2)整合各引物使之不相互干擾。(3)以引物序列組，擴(kuò)增待測(cè)樣品模板，進(jìn)行目的基因的特異性擴(kuò)增；(4)擴(kuò)增完畢后可通過使用商業(yè)化的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條對(duì)擴(kuò)怎產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)兩條紫紅色條帶，陰性結(jié)果呈現(xiàn)一條紫紅色條帶。該方法包括應(yīng)用該方法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌所使用的引物組和與之配套的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件。其中引物序列如下該引物序列參照GenBank 中的序列 EU29431. I Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica strain ATCC 9610 中 16S-23S rDNA 基因間序列為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物SEQ ID NO. I :5’ -GAGGTCAGCGGTTCGASEQ ID NO. 2 :5’ -TGTGGCTGCGAACACACTSEQ ID NO. 3 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAGSEQ ID NO. 4 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTSEQ ID NO. 5 :5’ -ACAGCAACCGGAGTGAAC。其中序列SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5使用特殊基團(tuán)標(biāo)記，擴(kuò)增產(chǎn)物中包含上述基團(tuán)，以便同核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條反應(yīng)。本專利技術(shù)中反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量Bst 酶5U/pLIpLBst酶緩沖液-5 μι SEQ ID NO. I10 μ mol/LO. 2 μ LSEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ LSEQ ID NO. 3:ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ LSEQ ID NO. 410 μ mol/LO. 8 μ LSEQ ID NO. 5:ΙΟμηιοΙ/L2μΙDNA樣品2 μ L雙蒸水8 μ L總體積20 μ L其中Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質(zhì)量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。等溫?cái)U(kuò)增程序?yàn)?3°C 60分鐘。擴(kuò)增完畢后可通過使用商業(yè)化的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條對(duì)擴(kuò)怎產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)兩條紫紅色條帶(分別為檢測(cè)線和質(zhì)控線)，陰性結(jié)果呈現(xiàn)一條紫紅色條帶(質(zhì)控線)。如出現(xiàn)其它結(jié)果則表明此次檢驗(yàn)失敗不能確定樣品中是否存在小腸結(jié)腸炎耶爾森囷，需重新檢驗(yàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果是相比傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法，基于等溫?cái)U(kuò)增的鑒定方法適用于直接從臨床樣品中擴(kuò)增靶基因，只需要一次等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)就能夠檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是否存在，大大提高了效率節(jié)約了時(shí)間。相比較其它PCR方法，本方法制僅需要簡(jiǎn)單的設(shè)備——一個(gè)恒溫水浴即可，大大提高了性價(jià)比節(jié)約了成本。等溫?cái)U(kuò)增方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定特異的目的病原體。它通過擴(kuò)增靶基因，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時(shí)間；該鑒定方法不受培養(yǎng)條件和病原體生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。附圖說明圖I樣品檢測(cè)結(jié)果，樣品DNA使用核酸恒溫?cái)U(kuò)增小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)，擴(kuò)增完畢后可通過使用商業(yè)化的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條對(duì)擴(kuò)怎產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)兩條紫紅色條帶(分別為檢測(cè)線和質(zhì)控線)，陰性結(jié)果呈現(xiàn)一條紫紅色條帶(質(zhì)控線)，試紙條I為陰性對(duì)照，試紙條2為I株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，試紙條3和4分別為2株小 腸結(jié)腸炎耶爾森菌野生株擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例I樣本1株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株的細(xì)菌培養(yǎng)物，2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌野生株的細(xì)菌培養(yǎng)物。I.樣品DNA抽提取Iml樣品培養(yǎng)物，離心得到沉淀物質(zhì)在Iml緩沖液中重懸，加入Iml裂解液，沸水浴10分鐘，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，取上清液置-20°c保存。3.等溫?cái)U(kuò)增體系中反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量Bst 酶5υ/μ Ιμ Bst酶緩沖液-5pLSEQ ID NO. I:10 μ mol/LO. 2 μ LSEQ ID NO. 2ΙΟμπιοΙ/LO. 2 μ LSEQ ID NO. 3:10 μ mol/LO. 8 μ LSEQ ID NO. 410 μ mol/L0.8 μ LSEQ ID NO. 5:10 μ mol/L2 μ DNA樣品2 μ L雙蒸水8 μ L總體積20 μ 其中Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質(zhì)量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。等溫?cái)U(kuò)增程序?yàn)?3 °C，60分鐘。等溫?cái)U(kuò)增共進(jìn)行4管檢測(cè)，其中DNA樣品所加入的分別為樣品I為陰性對(duì)照；樣品2為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)物的DNA樣本；樣品3和4為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌野生株培養(yǎng)物的DNA樣本。4.被檢測(cè)樣品結(jié)果觀察擴(kuò)增完畢后通過使用商業(yè)化的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條對(duì)擴(kuò)怎產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陰性對(duì)照顯示陰性結(jié)果，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株和野生株均顯示陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例2樣本某待測(cè)樣品。I.樣品DNA抽提某樣品懷疑含有小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，取Iml該樣品培養(yǎng)物，離心得到沉淀物質(zhì)·在Iml緩沖液中重懸，加入Iml裂解液，沸水浴10分鐘，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，取上清液置_20°C保存。3.等溫?cái)U(kuò)增體系中反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量Bst 酶5U/ μ LIpLBst酶緩沖液-5μ SEQ ID NO. I:ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ LSEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ LSEQ ID NO. 3:10 μ mol/LO. 8 μ LSEQ本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試劑及其擴(kuò)增方法，其特征在于，包括以下五個(gè)引物：SEQ？ID？NO.1：5’？GAGGTCAGCGGTTCGASEQ？ID？NO.2：5’？TGTGGCTGCGAACACACTSEQ？ID？NO.3：5’？GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAGSEQ？ID？NO.4：5’？GCGTCGTTGTGCAGTSEQ？ID？NO.5：5’？ACAGCAACCGGAGTGAAC。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張霞，鄭文杰，趙良娟，吳冬雪，曲鵬，張宏偉，劉培，高旗利，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：