本發(fā)明專利技術(shù)公開一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測(cè)與乳腺癌變前期病理演變有密切相關(guān)的磷酸甘油酸脫氫酶（PHGDH）基因的mRNA方法，包括以下步驟：（1）在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和（2）檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒和檢測(cè)方法可在mRNA水平上檢測(cè)PHGDH基因的表達(dá)量，比影像醫(yī)學(xué)和現(xiàn)有的臨床生化檢測(cè)指標(biāo)更早期，能實(shí)現(xiàn)真正的癌變前期mRNA水平篩查，同時(shí)，本發(fā)明專利技術(shù)的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單方便，成本低,便于縣區(qū)級(jí)醫(yī)院推廣應(yīng)用。?
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與乳腺癌變前期的mRNA表達(dá)改變(病理演變過程)的相關(guān)檢測(cè)技術(shù)。
技術(shù)介紹
根據(jù)國(guó)內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的資料，我國(guó)每年癌癥的新增人數(shù)260萬，死亡人數(shù)近210萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800萬，患者約有8400多萬人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。癌癥診治成本越來越高，按癌癥患者的年治療費(fèi)用20萬(貧窮地區(qū)可能偏高，發(fā)達(dá)地區(qū)可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出20萬)，700多萬患·者，每年的花費(fèi)是I. 4萬億，扣除成本35%約4千億，每年約有I萬億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會(huì)在治療后不久死亡。因此，現(xiàn)有的臨床癌癥診治模式一定要改變，本專利技術(shù)的創(chuàng)新點(diǎn)是提前做到預(yù)防性篩查，然后及時(shí)介入預(yù)防性調(diào)控和預(yù)防性治療，做到基因水平癌癥的治未病。2005年美國(guó)衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了一個(gè)年度報(bào)告，對(duì)1972年發(fā)起的抗癌大戰(zhàn)進(jìn)行回顧，報(bào)告認(rèn)為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗，結(jié)論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個(gè)因素是1.腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性(多態(tài)性);2.腫瘤細(xì)胞耐藥性；3.抗癌藥物設(shè)計(jì)思路不完善(動(dòng)物模型設(shè)計(jì)不科學(xué))等。同時(shí)，該報(bào)告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本專利技術(shù)人在長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學(xué)影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、癌胚抗原、糖類激素、細(xì)胞膜因子、細(xì)胞核因子、細(xì)胞流式技術(shù))指標(biāo)來診斷癌癥，都是腫瘤形成后診斷，前者要有組織學(xué)變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋放、或腫瘤的標(biāo)記物。傳統(tǒng)臨床觀念認(rèn)為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這一概念值得認(rèn)真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模瑥募?xì)胞學(xué)角度來分析，I公分的腫塊約有一億個(gè)腫瘤細(xì)胞，2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn)不止2億個(gè)腫瘤細(xì)胞，從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當(dāng)長(zhǎng)，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實(shí)的是在這個(gè)病理演變過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨(dú)的病灶，可能癌細(xì)胞早已遷移到其它組織或器官生長(zhǎng)。臨床研究早已證實(shí)，一旦形成腫塊的同時(shí)，其它癌細(xì)胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長(zhǎng)，一旦切除原發(fā)灶后，其它器官?gòu)?fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時(shí)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，其實(shí)這時(shí)已經(jīng)是晚期診斷和晚期治療，這是導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預(yù)防癌癥，已取得長(zhǎng)足進(jìn)步。至今，我們已有可能在基因的一級(jí)轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預(yù)測(cè)和篩查。本專利技術(shù)采用核酸原位雜交技術(shù)，選擇多組臨床標(biāo)本(癌癥病人、高危人群、家屬史人群、正常對(duì)照)，對(duì)PHGDH基因與乳腺癌的早期預(yù)警進(jìn)行檢測(cè)分析。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，這種疾病通常發(fā)生在乳房腺上皮組織，發(fā)病率占各種惡性腫瘤的7-10%，是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。美國(guó)的研究人員巧妙地將癌癥基因組學(xué)技術(shù)與R NA干擾技術(shù)相結(jié)合，在乳腺癌小鼠模型中高通量篩查了 2725個(gè)代謝酶和運(yùn)輸子基因，從中發(fā)現(xiàn)了 198個(gè)與侵襲性乳腺癌相關(guān)的基因，其中包括一個(gè)被稱為磷酸甘油酸脫氫酶(PHGDH)的基因。研究人員發(fā)現(xiàn)PHGDH存在于“染色體lp”的一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域在約70%的雌激素受體(ER)陰性乳腺癌中經(jīng)常被放大，導(dǎo)致PHGDH過度表達(dá)。PHGDH的水平升高引起通過絲氨酸合成通道的代謝流量增加，這反過來又會(huì)對(duì)谷氨酸鹽通過三羧酸循環(huán)向-酮戊二酸鹽的流入做出顯著貢獻(xiàn)。當(dāng)研究人員在這些乳腺癌細(xì)胞中抑制PHGDH基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖受到抑制，絲氨酸合成下降。進(jìn)一步的分析證實(shí)PHGDH抑制并不會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)絲氨酸水平，而主要是導(dǎo)致三羧酸循環(huán)向-酮戊二酸鹽的流入的降低。這些研究結(jié)果表明，以PHGDH為具體目標(biāo)，作為乳腺癌變前期篩查的靶基因有一定的臨床意義。將PHGDH的mRNA作為早期篩查乳腺癌變前期有非常重要的臨床診斷意義。PHGDH的mRNA在乳腺癌變前期及癌變過程中表達(dá)過度。它作于乳腺癌變前期篩查、及乳腺腺癌治療后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移預(yù)警也有非常重要的臨床意義。專利技術(shù)人在長(zhǎng)期的研究中，得出了一種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病,只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率,降低社會(huì)成本和醫(yī)療成本。因此,專利技術(shù)人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了大膽創(chuàng)新。特別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、癌癥高危人群、癌癥好發(fā)人群、腫瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤組織比較的一貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)癌前變的mRNA水平，與癌癥早期基因病理生理學(xué)演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標(biāo)，將臨床上腫瘤形成后診治模式變成腫瘤的預(yù)防性診治，爭(zhēng)取了腫瘤診治的時(shí)間和空間，達(dá)到預(yù)防癌癥。目前對(duì)PHGDH基因的研究都采用高通量基因芯片技術(shù)，而這些方法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，特別是個(gè)性化的應(yīng)用在我國(guó)現(xiàn)階段條件尚不成熟。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料PHGDH基因mRNA水平的檢測(cè)技術(shù)及試劑盒未見報(bào)道。本專利技術(shù)人在針對(duì)創(chuàng)新性專利技術(shù)的要求，設(shè)計(jì)了不同數(shù)據(jù)例組(乳腺癌患者、高危人群和家屬發(fā)病史人員、正常對(duì)照人)例組，用原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明以上乳腺癌癥病人PHGDH基因都過度表達(dá)，高危人群有不同程度表達(dá)15-25%，家屬發(fā)病史人員有幾例呈低表達(dá)，正常人都是零表達(dá)。表明PHGDH基因乳腺癌變前期篩查的重要標(biāo)志物。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對(duì)何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于 以后的檢測(cè)。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測(cè)這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA, R本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ？ID？NO.1所示的序列。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：裘霖，張玉麗，裘建英，張?jiān)聘?/a>，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：芮屈生物技術(shù)上海有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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