本發明專利技術經輻照誘變得到了一株新的納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160。與野生菌BSNK-5相比，BSNK-T160的酪蛋白水解活性提高了46.9%，65℃熱穩定性提高約8倍；相對于尿激酶的纖維蛋白活性提高了29.62%，熱穩定性提高了82.31%。本發明專利技術得到的BSNK-T160菌株可用于生產高活、熱穩定性納豆激酶。用該新菌株發酵大豆24h便可產出納豆，且所得納豆品質優良。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物領域，特別是涉及一種新的高活、熱穩定性納豆激酶生產菌株及其在發酵生產納豆及納豆激酶方面的應用，本專利技術還涉及該菌株產生的發酵制品。
技術介紹
納豆激酶(nattokinase,NK)是由納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus natto)分泌表達的高效纖維蛋白溶解酶，最早從傳統的日本大豆發酵產品納豆中發現。與臨床應用的溶栓藥物相比，具有溶纖活性高、安全可靠、無毒副作用、半衰期長、在胃腸道中穩定性好，生產成本低廉等優點。盡管國內外學者從不同的大豆發酵產品中分離和篩選出了一些高產納豆激酶菌 株，并進行了優化發酵條件以提高納豆激酶的產量、異源表達提高納豆激酶的純度、通過菌種選育提高納豆激酶的活力等研究，但對提高納豆激酶熱穩定方面的研究鮮有報道。實踐中真正可用于產業化生產納豆激酶的菌株很少。特別是，由于納豆激酶對熱不穩定，一直是限制該酶在保健食品、醫藥領域應用的瓶頸。因此，得到高活性和熱穩定性的納豆激酶菌株需求十分迫切。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供新的高活、熱穩定性納豆激酶生產菌；本專利技術的直接目的是篩選出一種新的納豆枯草芽孢桿菌，使其可用于較大量生產納豆及高活、熱穩定性納豆激酶。本專利技術人通過800Gy6°Co- Y射線輻照誘變納豆枯草芽孢桿菌BSNK-5，采用酪蛋白平板法經過多次點板傳代反復篩選，結合65°C處理得到了高活、熱穩定性突變菌株一納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus natto)BSNK_T160,該新菌株已于2012年10月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6714。本專利技術所述的納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160特征為形態特征菌株的菌落在LB平板上呈圓形，直徑2_4mm，乳白色，不透明，邊緣不整齊，表面干燥，有皺褶，用接種環挑菌落有拉絲現象，菌落與培養基不結合，菌落正反面顏色相同。顯微鏡下個體形態觀察，菌株桿狀，長3-4 μ m，寬O. 8-1 μ m,兩端鈍圓，革蘭氏染色呈陽性，產芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生，見圖I和圖2。培養特征BSNK-T160生長所用的培養基為LB培養基，輻照誘變所用的篩選培養基為酪蛋白培養基，培養溫度為30-37°C。所述酪蛋白培養基的配方為酪蛋白1%、酵母提取物O. 5%、NaCl O. 9%、瓊脂2%，ρΗ7· 2-7. 4，121°C 滅菌 20min，現用現配。本專利技術固體發酵所用的培養基為大豆，發酵溫度為38_40°C。由納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160發酵產生的發酵制品也屬于本專利的的保護范圍。所述發酵制品可為發酵產品本身、經稀釋過的發酵產品或經純化的發酵產品；所述發酵制品可采用顆粒、粉末、片劑等固體外形或是液體、糊狀、膠狀等流體外形。專利技術效果經酪蛋白平板法篩選，纖維蛋白平板法檢測篩選菌株的纖維蛋白溶解活性和熱穩定性，固體發酵驗證菌體的發酵能力等實驗證實與野生型菌株BSNK-5相比，突變菌株BSNK-T160具有以下有益效果I、提高了酪蛋白水解活性和熱穩定性在37°C的酪蛋白水解活性提高了 46. 9%，65°C熱穩定性提高約8倍(圖3)2、提高了纖維蛋白溶解活性，特別是在65°C高溫下的活性·纖維蛋白平板檢測結果表明BSNK-T160在37°C的溶解圈面積增加了 20. 93%，相對于尿激酶的活性提高了 29. 62% ;65°C熱處理后溶解圈面積增加了 32. 13%，相對于尿激酶的活性提高了 82.31% (圖4)。3、由納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160發酵產生的發酵制品質量好固態發酵實驗進一步證實接種BSNK-T160菌株24h后便在大豆表面形成一層白膜，呈粘性，拉絲較長，所得納豆顏色發黃，有金屬光澤，具有醬香味(圖5)。本專利技術的BSNK-T160的優點如下I、較高的纖維蛋白水解活性；2、較好的熱穩定性；3、發酵速度快，24小時就可發酵大豆產納豆,大于市場納豆菌發酵產納豆最少需要 48h。4、發酵所得納豆品質好，沒有氨臭味，具有醬香味。因此，BSNK-T160菌株是理想的研究、應用的出發材料菌株。在納豆激酶及納豆的生產領域中具有實現其產業化的極大可能，并具有廣闊的醫藥、食品應用和市場前景。附圖說明圖I為納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160的菌落形態圖；圖2為納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160的菌體形態圖；圖3為不同溫度處理后BSNK-T160的酪蛋白水解活性圖；圖4為不同溫度處理后BSNK-T160相對于尿激酶的活性圖；圖5為BSNK-T160固體發酵產納豆圖。生物材料保藏信息名稱納豆枯草芽抱桿菌(Bacillussutilis natto) BSNK-T160保藏編號CGMCCNo. 6714保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏時間2012年10月29日。具體實施例方式以下實施例僅用于舉例說明本專利技術的方法，并不限制本專利技術的范圍。 實施例I高活熱穩定性突變菌株BSNK-T160篩選I.材料I. I 菌種BSNK-5,由專利技術人實驗室從我國黑豆豆豉分離、篩選和鑒定的納豆枯草芽孢桿菌。I. 2培養基種子和液體發酵培養基LB培養基；篩選培養基酪蛋白平板培養基。I. 3活力測定方法酪蛋白平板法將平板(9cmX 9cm)放在水平儀上調水平，用IOmM pH7. 2PBS溶液配制1%的瓊脂糖，微波爐加熱使之融化，加入pH8. OTris-HCl緩沖液配制的等體積酪蛋白溶液，使終濃度為3mg/ml，趁熱倒入平板中，將氣泡趕至邊緣，室溫下凝固。用直徑5_的打孔器打孔，將待測樣品點入孔內，37°C保溫18h，小心取出平板，考馬斯亮藍染色，7%冰乙酸脫色，酪蛋白被水解后，點樣孔周圍顯示透明圈，其余部位為藍色。2 方法2. I菌懸液制備從活化好的BSNK-5平板接單菌落到20ml LB液體培養基，30°C培養大約8_10h，到0D600為O. 8-1. 0，取出，離心收集菌體(6000rpm，5min)，生理鹽水清洗2次，用等體積生理鹽水溶解，備用。2. 2 60Co- Y射線輻照誘變取Iml上述菌液，加入9ml生理鹽水，SOOGy進行輻照誘變。將輻照誘變菌液進行倍比稀釋，取100 μ I涂酪蛋白平板，每個梯度涂10個酪蛋白平板，30°C過夜培養。2. 3高活菌株篩選高活菌株初篩隨機選取照射后生長菌株點酪蛋白平板，以未經照射菌株為對照，30°C過夜培養。次日取出，選取正突變株(即酪蛋白平板溶解圈直徑與菌落直徑比值比對照菌株溶解圈直徑與菌落直徑比值增大10%的菌株)，重復點酪蛋白平板多次，進行溶解圈觀察。高活菌株復篩將最終確認穩定菌株經3ml LB液體培養基、30°C、220rpm培養5h，取發酵液10 μ I點酪蛋白平板，30°C培養18h，計算溶解圈面積，選取誘變菌株溶解圈面積比對照菌溶解圈面積增大10%的菌株進行熱穩定性分析。2. 4熱穩定性菌株篩選將篩選菌株發酵液經37、55、60和65°C處理15min，酪蛋白平板檢測活性，將熱處理后溶解圈面積比對照菌株大的菌株作為正突變菌株。3 結果利用SOOGy6ciCo- Y輻照BSNK-5菌株，結合熱處理，酪蛋白平板法篩菌得到活性和熱穩定提高菌株BSNK-T160(菌落與菌體形態見圖I和2)。野生型菌株BSNK-5在37°C的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus?natto）BSNK?T160，CGMCC?No.6714。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：唐選明，李淑英，聶瑩，
申請(專利權)人：中國農業科學院農產品加工研究所，
類型：發明
國別省市：
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