一種地加瑞克的合成方法技術

本發明專利技術公開了一種地加瑞克的人工合成方法，以Fmoc保護的氨基樹脂為起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/HOBt為偶聯劑進行接肽反應，4位絲氨酸以叔丁基二甲基代替叔丁基保護羥基，5位苯丙氨酸苯環4位氨基相連的氫化乳清酸片段先以三苯甲基保護，最后再引入，避免了重排副反應發生，以D-4Aph(Cbm)代替D-4Aph(Cbm-tBu)，避免了t-Bu脫除困難，減少了副反應發生。本發明專利技術的合成工藝步驟簡單，易于控制，環境污染小，收率高，適于工業化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種具有生理活性的多肽的合成方法，具體地說是地加瑞克的人工合成方法。
技術介紹
地加瑞克，英文通用名Degarelix，是一種促性腺激素釋放激素(GnRH)受體抑制劑類藥物，可逆性抑制垂體GnRH受體來減少促性腺激素釋放繼而抑制睪酮的釋放，通過抑制對前列腺癌持續生長至關重要的睪酮而延緩前列腺癌的生長和惡化。是目前唯一臨床用于晚期前列腺癌的GnRH受體拮抗劑。其氨基酸序列為，Ac-D-2Nal-D-4 Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph (L-Hor)_D_4Aph(Cbm)-Leu-Ilys· -Pro-D-Ala-NH2,結構式如下 γ,η. . I · MN 感 in: 地加瑞克從用藥開始就能降低睪酮濃度，不會產生如GnRH激動劑(如戈舍瑞林、亮丙瑞林等)帶來的“先升后降”現象。Degarelix降低睪酮濃度的效果與亮丙瑞林儲庫型控釋注射劑相當，并且降低睪酮濃度在統計學上顯著快，在治療的整個I年中始終抑制前列腺特異抗原。地加瑞克能快速、持久的控制睪酮水平來抑制前列腺癌的發展，并且耐受性與目前上市藥物相當。隨著中國社會老齡化加快，前列腺癌的發病逐年提高，Degarelix的市場潛力巨大。地加瑞克為含有7個非天然氨基酸的線性十肽，其中含有5個氨基酸為D構型氨基酸。專利文獻最初由Ferring公司Semple Graeme和Jiang Guangcheng合作研發，專利文獻W09846634報道的地加瑞克固相合成方法，采用Boc策略，以N-Boc-D-Ala偶合于樹脂上，然后以TFA脫除Boc保護基，然后按照氨基酸的次序進行接肽反應，脫保護。其中5位和6位的4-氨基苯丙氨酸(Aph)需要采用Fmoc保護基進行保護，然后再用哌啶/DMF溶液脫除，再與叔丁基異氰酸酯或L-氫化乳清酸反應，然后再順次接連下一肽鍵。最后經醋酸酐酰化后，用 HF 脫除 4 位的 Ser-OBn，6 位的 Aph-Cbm-tBu 和 8 位的 Lys-NCbz。W09846634還提到了另外一種方法，只是5位氨基酸側鏈上的乳清酸放在整個肽鏈完成之后再引入。專利文獻US6214798B1公開一種地加瑞克的液相合成方法，提出的液相合成方式更適合大量制備產品。最終產品的純度大約在98%，然而在已有文獻指出(J. Med.Chem.，2005,48, 4851-4860)按照同樣方式制備的產品通過毛細管區域凝膠電泳測量純度為98%，HPLC測量僅為96%。并且最后使用HF等危險氣體，不利于工業生產。專利文獻W02010121835公開了一種采用Fmoc法來制備Degarelix的技術方案，由文獻(J. Chem. Soc. Perkin, Trans. 2，1984, pgl077_1081; Org. BiomoI. Chem. , 2004,pgl098-1103)可知，5 位氨基酸側鏈上的L-氫化乳清酸結構在堿性條件下不穩定，容易重排生成海因(Hydantoin)結構的副產物。并且通過實驗發現在濃NaOH調節pH值處理時會生成4. 5%重量比的副產物，2%的DBU/DMF(1, 8- 二氮雜二環 i^一碳-7-烯/基)處理degarelix產生I. 8%海因結構產物，如果含5%的水，副產物則增加至7%。但是在20%的哌啶/DMF (二甲基亞砜)溶液中degarelix沒有任何降解。最后采用該法可以制備小于O.3%重量百分比的相關物質的degarelix，并且減少了 L-氫化乳清酸的重排產物生成，另外避免了上述Boc法大量使用TFA，減少了環境危害，降低了對人體的高毒的TFA (三氟乙酸)的危害。專利文獻W02011066386指出上述Fmoc策略中使用t_Bu保護絲氨酸的羥基，脫保護試驗表明，一般條件并不能完全脫除t-Bu保護，需要100%的TFA (三氟乙酸)處理25小時才能完成脫保護，在這種強烈的反應條件下，副反應和副產物的增多，會影響了最終產品的質量，如果采用45°C反應可以完全脫除，但是仍會產生降解產物影響最終產品的質量。采用Trt保護絲氨酸的羥基，可以在95%TFA (三氟乙酸)，2. 5%TIS (三異丙基硅烷)，2. 5EDT(1，2-乙二硫醇)溶液中45°C下廣2小時脫除。采用這一策略制備的Degarelix HPLC純度達到98. 5%以上，采用酸容易解離的Trt保護，由于Trt基團的空間位租大和疏水性，造成肽鍵形成困難，需要較長的反應時間進而產生更多的副產物以及序列肽缺失和消旋。因此，急需一種工藝簡單、易于控制質量且適于大工業生產的1，4，5，6_四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工化學合成工藝。
技術實現思路
針對上述現有技術，本專利技術提供了地加瑞克的的人工合成方法。本專利技術是通過以下技術方案實現的 一種地加瑞克的固相合成方法，包括以下步驟 以Fmoc保護的氨基樹脂為起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/ HOBt為偶聯劑進行接肽反應，依次連接Fmoc保護的氨基酸，獲得保護的十肽樹脂，期間依次脫去氨基酸上的Fmoc基團，獲得保護的十肽樹脂后，脫除氨基酸的側鏈保護基，切肽獲得地加瑞克粗品，然后純化的地加瑞克，包括以下步驟 1)樹脂溶脹和脫保護 將Fmoc保護的氨基樹脂裝入固相反應柱中，以DMF洗滌Γ4次，然后以DCM溶脹20 40分鐘，抽濾去除DCM，加入20% DBLK溶液脫除氨基樹脂的Fmoc保護基，然后以DMF洗滌4飛次； 2)制備Fmoc- D-Ala-樹脂 冰浴下將Fmoc-D-Ala-OH和HOBt溶于DMF中，然后加入DIC活化5 10分鐘，將活化好的溶液重復加入步驟I)所得的樹脂中反應，至茚三酮檢測法檢測樹脂呈陰性時停止反應，樹脂以DMF洗滌4飛次，得Fmoc- D-Ala-樹脂；3)制備Fmoc-D-Ala- Pro- ILys (Boc) - Leu- D~4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)-Ser(x)- D-3Pal- D-Phe (4C1) - D_2Nal_ 樹脂: 將步驟2)所得的Fmoc- D-Ala-樹脂用DMF洗滌2 6次，加入20% DBLK溶液脫除Fmoc保護基，以DMF洗滌4飛次，然后按照步驟2)的操作進行接肽反應，依次將 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys (Boc) -OH> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D_4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-L_4Aph (Trt)-OH、Fmoc-Ser (X)-OH、Fmoc -D-3Pal_0H, Fmoc -D-Phe (4C1) -OH, Fmoc-D-2Nal-0H按照地加瑞克的氨基酸序列進行連接； 4)制備Ac-D-Ala- Pro- ILys (Boc) - Leu- D~4Aph (Cbm) - L-4Aph (Trt) - Ser (x)-D-3Pal- D-Phe (4C1) - D_2Nal_ 樹脂: 步驟3)反應完畢后將樹脂以DMF洗滌2 6次，加入20% DBLK溶液脫除Fmoc保護基，然后加入乙酸酐和吡啶，用茚三酮檢測法檢測，反應完成后抽干，以DMF洗滌31次；5)制備Ac-Ala- Pro- ILys (Boc) - Le本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，包括以下步驟：以Fmoc保護的氨基樹脂為起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/?HOBt為偶聯劑進行接肽反應，依次連接Fmoc保護的氨基酸，獲得保護的十肽樹脂，期間依次脫去氨基酸上的Fmoc基團，獲得保護的十肽樹脂后，脫除氨基酸的側鏈保護基，切肽獲得地加瑞克粗品，然后純化的地加瑞克，包括以下步驟：1）?樹脂溶脹和脫保護將Fmoc保護的氨基樹脂裝入固相反應柱中，以DMF洗滌1~4次，然后以DCM溶脹20~40分鐘，抽濾去除DCM，加入20%?DBLK溶液脫除氨基樹脂的Fmoc保護基，然后以DMF洗滌4~6次；2）制備Fmoc??D?Ala?樹脂:冰浴下將Fmoc?D?Ala?OH和HOBt溶于DMF中，然后加入DIC活化5~10分鐘，將活化好的溶液重復加入步驟1）所得的樹脂中反應，至茚三酮檢測法檢測樹脂呈陰性時停止反應，樹脂以DMF洗滌4~6次，得Fmoc??D?Ala?樹脂；3）制備?Fmoc?D?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph(Trt)??Ser(x)??D?3Pal??D?Phe（4Cl）??D?2Nal?樹脂：將步驟2）所得的Fmoc??D?Ala?樹脂用DMF洗滌2~6次，加入20%?DBLK溶液脫除Fmoc保護基，以DMF洗滌4~6次，然后按照步驟2）的操作進行接肽反應，依次將Fmoc?Pro?OH、Fmoc?ILys（Boc）?OH、Fmoc?Leu?OH、Fmoc?D?4Aph(Cbm)?OH、Fmoc?L?4Aph(Trt)?OH、Fmoc?Ser(x)?OH、Fmoc??D?3Pal?OH，Fmoc??D?Phe（4Cl）?OH，Fmoc??D?2Nal?OH按照地加瑞克的氨基酸序列進行連接；4）制備Ac?D?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph(Trt)??Ser(x)??D?3Pal??D?Phe（4Cl）??D?2Nal?樹脂：步驟3）反應完畢后將樹脂以DMF洗滌2~6次，加入20%?DBLK溶液脫除Fmoc保護基，然后加入乙酸酐和吡啶，用茚三酮檢測法檢測，反應完成后抽干，以DMF洗滌3~8次；5）制備Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph??Ser(x)??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?樹脂:在裝有Ac?D?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph(Trt)??Ser(x)??D?3Pal??D?Phe（4Cl）??D?2Nal?樹脂的的固相反應柱中加入體積比為10％的TFA/DCM溶液，室溫攪拌反應后，抽干，以DMF洗滌3~8次；6）制備Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph（Hor）??Ser(x)??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?樹脂:將L?4,5?二氫乳清酸溶于DMF中，加入HOBt，再加入DIC活化，然后將活化好的溶液加入裝有Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph??Ser(x)??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?樹脂的的固相反應柱中，攪拌反應2小時后，茚三酮檢測呈陰性，抽干，DMF洗滌3~8次；7）制備Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph（Hor）??Ser??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?樹脂：在裝有Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph（Hor）??Ser(x)??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?樹脂的固相反應柱中，加入TBAF的DMF溶液,攪拌反應2小時后以DMF洗滌3~8次；8）裂解制備粗肽：將冰凍的裂解液加入到烘干的樹脂中，攪拌反應2小時，將反應液加入乙醚中，冰凍20~60分鐘，離心，以DMF洗滌6次，至pH為中性為止，分離，干燥后得粗肽；9）純化得地加瑞克精肽：將步驟8）所得粗肽經分離純化得地加瑞克精肽；所述氨基樹脂選自Rink?amide?AM、?Rink?amide?MBHA中的一種；步驟2所述Fmoc?Ser(x)?OH?的保護基x選自TBDMS、OBn中的一種；步驟8）所述裂解液由TFA、TIS、苯酚、苯甲醚組成，TFA、TIS、苯酚、苯甲醚的體積比為95:?2:2:1。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：厲保秋，袁強，陳明魯，房世紅，董欣，李娜，
申請(專利權)人：濟南環肽醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：