一株滇牡丹內生擬莖點霉菌制造技術

本發明專利技術涉及微生物技術領域，特別是涉及一種具有廣譜抗菌活性的微生物菌株。本發明專利技術所述的滇牡丹內生擬莖點霉菌命名為擬莖點霉菌YE3250（Phomopsissp.YE3250），現保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCCNO：M2012364。本發明專利技術首次從滇牡丹植物（Paeoniadelavayi）中分離獲得擬莖點霉類型的內生真菌，并發現擬莖點霉菌YE3250對2種革蘭氏陽性細菌、1種革蘭氏陰性細菌、2種人體致病真菌和4種植物病原真菌，共9種病原微生物具有較明顯的抑制生長作用。本發明專利技術目的是利用植物內生真菌資源，通過發酵以求獲得醫用或農用的新型天然抗菌藥物活性成分。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物
，特別是涉及一種具有廣譜抗菌活性的微生物菌株。
技術介紹
滇牡丹iPaeonia delavayi Franch.)屬茍藥科茍藥屬牡丹組植物,為中國西南地區特有種，其性寒、味酸辛，根皮用于清熱涼血，治吐血、尿血、血痢、痛經等，也被用作丹皮藥用，可抑制中樞神經系統，有擴張冠狀血管，降壓、抑菌、抗炎、抗凝血等功能。我們從生長在云南省嵩明縣的滇牡丹植物中分離獲得了內生真菌，并進行了形態鑒定和抗菌活性的篩選(苗翠蘋等，中國藥學雜志，2011，必，738 )。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種分離自中國云南省嵩明縣滇牡丹{Paeonia de lavayiFranch.)植物活體中具有廣譜抗菌活性的微生物菌株滇牡丹內生擬莖點霉菌。本專利技術所述的滇牡丹內生擬莖點霉菌系從中國云南省嵩明縣滇牡丹植物活體中分離獲得。現在國家知識產權局認可的保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏單位地址中國，武漢大學，郵政編碼430072。保藏日期為2012年9月19日，保藏編號為CCTCC NO M 2012364。本專利技術所述的滇牡丹內生擬莖點霉菌命名為擬莖點霉菌YE3250 (PAomopsis sp.YE3250)，現保藏在國家知識產權局認可的保藏單位，保藏編號為CCTCC NO M 2012364。菌株YE3250的固體培養特征 UPDA培養基上菌落生長迅速，28°C培養7天，菌落直徑達7. 5 cm,菌絲灰白色，生長松散，呈輻射狀，邊緣整齊。培養15天后，在培養基表面出現載孢體，載孢體基內生長，成熟后 位于培養基表面。2、查氏培養基上菌落生長較慢，28°C培養10天，菌落直徑達8. I cm，中間向上鼓起，白色絨狀，菌落灰白色，邊緣整齊。培養15天無載孢體產生。3、麥芽汁培養基上菌落生長最慢，28°C培養12天，菌落直徑達7. 9 cm，菌絲較薄，生長較為松散，四周菌絲匍匐狀，表面灰白色，邊緣整齊。培養15天無載孢體產生。菌株YE3250的顯微形態特征(見圖I、圖2、圖3) 菌絲生長旺盛，交織生長，透明有隔，有核。取子座剖開后壓片觀察，有α、β兩種分生孢子，分生孢子梗無色，單枝至合軸分枝，α分生孢子無色，油球一般為2個，β分生孢子無色，一端為鉤型，單胞。菌株ΥΕ3250的分子生物學特征 采用分子生物學PCR技術，DNA序列測定分析，菌株ΥΕ3250的ITS rDNA基因組由558個堿基(bp)組成。以ITS rDNA序列為基礎構建系統發育樹，該菌為擬莖點霉屬(見圖4)。 菌株YE3250的液體發酵培養 I、PDB培養基搖瓶培養7天，培養溫度28 ± 2°C。2、發酵培養特征培養第I天，有零星的白色菌絲點出現；培養第3天，發酵液中白色菌絲增多，有少量菌絲帖壁；培養第5天，發酵液菌絲體密集，菌絲體呈灰白色；培養第7天，發酵液菌絲體密集成塊狀，呈灰白色，發酵液粘稠。菌株YE3250的發酵工藝活化菌種(PDA培養基，28±2°C，培養7天) ——制備種子液(PDB培養基，28±2°C，搖床200 r/min,培養3-4天)——液體發酵(按5%接種量，PDB培養基，28±2°C，搖床200 r/min,培養7天)。上述發酵工藝中PDB培養基(馬鈴薯葡萄糖液體培養基)的制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水I升煮沸30分鐘，過濾， 濾液加水補足至I升，加入葡萄糖20克，pH自然。上述培養基中加入15克瓊脂，即為PDA培養基。發酵完畢，加入等體積95%乙醇浸提48小時，過濾，將濾液濃縮至干，加入無菌水制得抗菌發酵液制品。本專利技術所述的菌株YE3250的抗菌活性試驗 I、病原指示菌共14株革蘭氏陽性細菌包括金黃色葡萄球菌{Staphylococcusaureus)、藤黃八疊球菌 iSarcina Iutea)、枯草芽抱桿菌{Bacillus subtil is)；革蘭氏陰性細菌包括大腸桿菌{Escheri chi a coli)、銅綠色假單孢菌iPsoudomormsaerwgifliosa);人體致病真菌包括白色念珠菌{Candida、星形石膏樣毛癬菌{Trichophyton gjpsea )、緊密單抱枝霉 iBormodendrum compactum);植物病原真菌包括稻痕霉(/yricw/aria orjzae)、灰葡萄抱ciflerea )、禾谷鍵刀菌(/7W1Saria graminearum)> ^ 1 袍SFusarium avenaceum')^ ΞΕ ^ ^{HeIminthosporiummaydis) > H ( (Aspergillus niger) o2.病原指示菌培養基細菌類指示菌采用牛肉膏蛋白胨培養基；人體致病真菌類指示菌采用沙氏培養基；植物病原真菌類指示菌采用PDA培養基。3.內生真菌的培養 將滇牡丹內生擬莖點霉菌株YE3250接入含7 mL PDB液體培養基的三角瓶中，置于28±2°C，搖床200r/min培養7天，加入等體積95%乙醇浸提48小時，過濾，將濾液濃縮至干，加入無菌水制成濃度為lmg/ml的發酵液樣品備用。4.抗菌活性的測定 采用濾紙片擴散法(Barry A L et al, J. Clin. Microbiol.，1979，10, 885)測定對14種病原微生物的抑制生長活性，濾紙片直徑為10_。在無菌條件下分別取供試指示菌懸液O. 2mL，加入相應的固體培養基制成含菌平板，然后取蘸有發酵液樣品的無菌濾紙片放入平板內，細菌和人體致病真菌置于37 ± I °C，植物致病真菌置于28 ± I °C，培養48h后，分別測量抑菌圈直徑大小，結果見圖5。本專利技術首次從滇牡丹植物de lavayi )中分離獲得擬莖點霉類型的內生真菌，確定為擬莖點霉菌sp.)，發現該菌對2種革蘭氏陽性細菌、I種革蘭氏陰性細菌、2種人體致病真菌和4種植物病原真菌，共9種病原微生物具有比較明顯的抑制生長作用。本專利技術利用植物內生真菌資源，通過發酵獲得農用或醫用新型天然抗菌藥物活性成分。附圖說明圖I為本專利技術所述的擬莖點霉菌YE3250的分生孢子梗顯微形態圖(400X)。圖2為本專利技術所述的擬莖點霉菌YE3250的分生孢子顯微形態圖(400X)。圖3為本專利技術所述的擬莖點霉菌YE3250的菌絲顯微形態圖(400X)。圖4為本專利技術所述的擬莖點霉菌YE3250及其相近種的系統發育樹圖。 圖5為本專利技術所述的擬莖點霉菌YE3250的抑菌活性結果(抑菌圈直徑)。具體實施例方式實施例 擬莖點霉菌YE3250菌株是通過發酵獲得農用或醫用新型天然抗菌藥物活性成分的微生物藥源。取YE3250菌種，在無菌條件下用接種針挑取少量菌絲，接種于裝有已滅菌的PDA培養基試管中，置培養箱內于28 ±2°C活化培養7天，備用。在無菌條件下，將活化好的菌種以相同方法接入已滅菌的PDB培養基中，在28±2°C培養3-4天，即為YE3250菌株的種子液。將配制好的PDB培養基IOOml裝入500ml三角瓶內，121°C滅菌30分鐘備用。取YE3250菌株的種子液，在無菌條件下接種于裝有100ml PDB培養基的500ml三角瓶內，接種量按5% (v/v)計，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種滇牡丹內生擬莖點霉菌，其特征在于：命名為擬莖點霉菌YE3250?（Phomopsissp.?YE3250），現保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC?No：M?2012364。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳少華，苗翠蘋，陳有為，
申請(專利權)人：云南大學，
類型：發明
國別省市：