本發(fā)明專利技術(shù)提供了一株具有抗腫瘤和酶抑制活性的海洋真菌——鏈格孢屬（Alternaria?sp.）MNP801及其應(yīng)用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號：CCTCC?No:M2012288，保藏日期2012年7月18日。本發(fā)明專利技術(shù)的有益效果主要體現(xiàn)在，提供了一株具有抗腫瘤和酶抑制活性的海洋真菌，具有抗HepG-2腫瘤細(xì)胞和PC12腫瘤細(xì)胞作用，同時(shí)具有胰蛋白酶抑制活性。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一株海洋真菌-鏈格孢屬(Alternaria sp. )MNP801,及其在制備抗腫瘤藥物和胰蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
尋找生理活性強(qiáng)的物質(zhì)發(fā)展成為抗癌、抗菌、抗氧化等藥物是人類攻克疾病的主要工作之一。海洋環(huán)境苛刻，具有低溫、低照、高鹽、高壓和寡營養(yǎng)等特點(diǎn)，海洋微生物由于棲息于這樣的極限環(huán)境下，產(chǎn)生了與陸地生物完全不同的代謝系統(tǒng)和機(jī)體防御系統(tǒng)，所以能產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、活性特異的次級代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)它們許多成分也具有抗癌，抗菌等藥用價(jià)值，并且許多特異的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型是在陸地微生物中難以發(fā)現(xiàn)的。細(xì)胞培養(yǎng)法是篩選抗腫瘤藥物比較常用的一種篩選方法，常用的有MTT法等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的是提供一株具有抗腫瘤和酶抑制活性的海洋真菌——鏈格孢屬(Alternaria sp. ) MNP801 及其應(yīng)用。本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是一株海洋真菌-鏈格孢屬(Alternaria sp. )MNP801,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC No :M2012288，保藏日期2012年7月18日。本專利技術(shù)還涉及所述的鏈格孢屬M(fèi)NP801在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，具體為所述鏈格孢屬M(fèi)NP801提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述抗腫瘤藥物具體可為治療肝癌或神經(jīng)癌的藥物。所述的鏈格孢屬M(fèi)NP801在制備胰蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用，具體為所述鏈格孢屬M(fèi)NP801提取物在制備胰蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述提取物為乙酸乙酯提取物，由如下方法制得將鏈格孢屬M(fèi)NP801接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25 35°C、15(T210r/min振蕩條件下培養(yǎng)14 30(1，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)細(xì)胞破碎后，離心取濾液用乙酸乙酯萃取，濃縮得浸膏(密度為I. 2^1. 7g/ml),即為所述鏈格孢屬M(fèi)NP801的乙酸乙酯提取物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為麥芽浸粉3. 0 7. Og/L,麥芽糖I. 5 2. Og/L,葡萄糖3. 0 7. Og/L,酵母浸粉0. 8 I. 5g/L，溶劑為水。具體的，所述乙酸乙酯提取物可按如下方法獲得a.海洋真菌MNP801的種子培養(yǎng)挑取海洋真菌MNP801菌株接入種子培養(yǎng)基，于25-35°C、150-210r/min培養(yǎng)48h，得到種子液；種子培養(yǎng)基組成如下麥芽浸粉3. (T7. Og/L,麥芽糖I. 5^2. Og/L,葡萄糖3. (T7. 0g/L，酵母浸粉0. 8^1. 5g/L，溶劑為水；b.海洋真菌MNP801的發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 35°C、15(T210r/min培養(yǎng)21d，得到發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下麥芽浸粉3. (T7. Og/L,麥芽糖I. 5^2. Og/L,葡萄糖3. (T7. Og/L,酵母浸粉0. 8 1.5g/L，溶劑為水；c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液超聲破碎；d.將上述破碎好的發(fā)酵液過濾除去菌體；e.將上述過濾好的發(fā)酵液(濾液)，用乙酸乙酯萃取，濃縮揮干制的浸膏(I)；f.將上述菌體冷凍干燥，甲醇浸泡后，過濾除去菌體，濾液濃縮揮干，加入水成水溶液，用乙酸乙酯萃取，濃縮揮干制的浸膏(2)；g.將上述浸膏(1)，浸膏(2)合并，即得到發(fā)酵液的提取物。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本專利技術(shù)海洋真菌MNP801的乙酸乙酯提取物胰蛋白酶抑制活性IC5tl(ug/ml)為301. 56 ;對卩(12腫瘤細(xì)胞的半抑制率濃度IC50 (ug/ml)為92. 97，對HepG-2腫瘤細(xì)胞的半抑制率濃度IC5tl (ug/ml)為88. 81。本專利技術(shù)的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株具有抗腫瘤和酶抑制活性的海洋真菌，具有抗H印G-2腫瘤細(xì)胞(肝癌細(xì)胞)和PC12腫瘤細(xì)胞(神經(jīng)癌細(xì)胞)作用，同時(shí)具有胰蛋白酶抑制活性，為新藥研發(fā)提供了基礎(chǔ)。附圖說明圖I為平板培養(yǎng)基上海洋真菌MNP801的菌落形態(tài)；圖2為光學(xué)顯微鏡下海洋真菌MNP801的菌體形態(tài)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :( I)海洋真菌MNP801的種子培養(yǎng)挑取海洋真菌MNP801菌株(CCTCC No:M2012288)接入種子培養(yǎng)基，于28°C、200r/min培養(yǎng)48h，得到種子液；種子培養(yǎng)基組成如下麥芽浸粉6. Og/L,麥芽糖I. 8g/L，葡萄糖6. Og/L，酵母浸粉I. 2g/L，溶劑為水；(2)海洋真菌MNP801的發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子液以10%體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于28°C、200r/min培養(yǎng)21d，得到發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下麥芽浸粉6. 0g/L,麥芽糖I. 8g/L，葡萄糖6. 0g/L,酵母浸粉1.2g/L，溶劑為水；(3)有效成分提取將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液于細(xì)胞破碎儀下超聲破碎，然后過濾除去菌體，取濾液用等體積乙酸乙酯萃取，濃縮揮干制得浸膏I (密度約為I. 5g/ml)將上述菌體冷凍干燥，甲醇浸泡后，過濾除去菌體，濾液濃縮揮干，加入水成水溶液，用乙酸乙酯萃取，濃縮揮干制的浸膏2 (密度約為I. 5g/ml)；g.將上述浸膏1，浸膏2合并，即得到發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物。實(shí)施例2 :海洋真菌提取物的酶抑制，抗腫瘤活性試驗(yàn)I.胰蛋白酶抑制活性測試(I)胰蛋白酶抑制活性測試所需試劑的配制配制IOOOmlO. lmol/L的Tris-HCl緩沖液(三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液)加入6. 057g三羥甲基氨基甲烷、0. lmol/L的鹽酸385ml及I. 1099g CaCl2于蒸餾水中，并定容至Ho配制25ml2mM底物BAPNA (Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽):稱取底物BAPNAO. 0217g于容量瓶中，使用0. lmol/L的Tris-HCl緩沖液將其定容至25ml。配制50ml2mg ml/1的胰蛋白酶稱取胰蛋白酶0. Ig于50ml容量瓶中，使用0.lmol/L的Tris-HCl緩沖液將其定容至50ml。最后配制30% (v/v)乙酸用于停止反應(yīng)。 (2)胰蛋白酶抑制活性法測定活性將樣品提取物配成100 V- g mL_1 > 50 u g mL_1>25 u g mL'12. 5 y g mL'6. 25 ug -mr1等5個(gè)不同的濃度，于96孔板中加入待測樣品50 y L (Tris緩沖液溶解)，用等體積的緩沖液作為對照組，然后在樣品組和對照組中加入預(yù)先于37°C水浴孵化IOmin的2mg 胰蛋白酶50 ii L和2mM底物BAPNA100 u L，37°C保溫反應(yīng)30min后，再加入30%乙酸50 ii L終止反應(yīng)；空白組則在乙酸終止反應(yīng)之后，再加入底物BAPNA，其余操作同上，酶標(biāo)儀405nm下檢測OD。按下式計(jì)算抑制率抑制率(%)== X 100%用SPSS軟件測得海洋真菌MNP801的提取物胰蛋白酶抑制活性IC5tl (ug/ml)為301.53ug/ml。2.體外抗腫瘤活性測試采用H印g2，PC12兩種腫瘤細(xì)胞系,進(jìn)行MTT試驗(yàn)(I)取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0. 25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，用含血清10%的RPM1640培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2X IO5個(gè)/ml，每孔IOOul細(xì)胞懸液的量加入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株海洋真菌——鏈格孢屬（Alternaria?sp.）MNP801，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號：CCTCC?No:M2012288，保藏日期2012年7月18日。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王鴻，陳俊，謝燕瑾，
申請(專利權(quán))人：浙江工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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