藥物篩選方法、用于促進(jìn)胞外基質(zhì)交聯(lián)的藥物及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)一種藥物篩選方法、用于促進(jìn)胞外基質(zhì)交聯(lián)的藥物及其應(yīng)用，所述藥物篩選方法，用于篩選出對(duì)LOXL1基因表達(dá)有促進(jìn)作用的物質(zhì)，其中，所述藥物篩選方法中，包括以下步驟：A、構(gòu)建由人LOXL1基因啟動(dòng)子控制表達(dá)ZsGreen的二代慢病毒載體；B、用二代慢病毒載體感染人成纖維細(xì)胞，構(gòu)建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纖維細(xì)胞；C、藥物篩選：將所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纖維細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，將待測(cè)物質(zhì)加入到人成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中；培養(yǎng)；通過(guò)檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度是否增加來(lái)判斷待測(cè)物質(zhì)對(duì)LOXL1基因表達(dá)的促進(jìn)作用。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)所提供的方法操作簡(jiǎn)單，具有廣泛的適用性。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種藥物篩選方法、用于促進(jìn)胞外基質(zhì)交聯(lián)的藥物及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
彈性纖維為多種器官提供彈性，?而膠原蛋白為機(jī)體提供支撐作用。?現(xiàn)在已知，彈性纖維交聯(lián)度的降低會(huì)導(dǎo)致一系列的結(jié)締組織的病變，例如皮膚松弛、肺氣腫、心血管異常、血管增生誘發(fā)的視網(wǎng)膜黃斑退變、性器官脫垂及尿失禁。這些病變均屬老年性慢性病，雖然不致死但大大影響人們的生活質(zhì)量。因此，探索提高機(jī)體的彈性纖維的維護(hù)是提高人們生活質(zhì)量的重要手段。彈性蛋白多聚體沉積是彈性纖維維持交聯(lián)度的一個(gè)重要因素，早于2004及2006年，Liu?及其同事發(fā)現(xiàn)賴酰基氧化酶1?（Lysyl?oxidase-like?1,?LOXL1）?是特異地維護(hù)機(jī)體彈性纖維的發(fā)育及其更新的關(guān)鍵因子。沒(méi)有LOXL1直接特異性地影響彈性纖維的交聯(lián)形成，進(jìn)而導(dǎo)致一系列的動(dòng)態(tài)結(jié)締組織的病變，包括皮膚松弛、肺氣腫、心血管異常、血管增生誘發(fā)的視網(wǎng)膜黃斑退變、性器官脫垂及尿失禁。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著組織器官的老化，LOXL1的水平大大降低，并伴隨著彈性纖維交聯(lián)度的下降及彈性蛋白單體無(wú)序堆積的增加。這些發(fā)現(xiàn)揭示通過(guò)增強(qiáng)LOXL1蛋白的表達(dá)水平或活性能延緩生物有機(jī)體胞外基質(zhì)的衰老過(guò)程（Nature?Genetics?2004?(36):178，?Am?J?Path?2006（168）:?519；?IOVS?2008?（49）:2599；WO/2005/069975，US?Patent?7255856，US?Patent?7255857，European?patent?EP1706139）。<br>但是，現(xiàn)有技術(shù)還有沒(méi)有出現(xiàn)一種藥物篩選方法，能用于篩選出對(duì)LOXL1蛋白的表達(dá)水平或活性有效促進(jìn)作用的物質(zhì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種藥物篩選方法、用于促進(jìn)胞外基質(zhì)交聯(lián)的藥物及其應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有方法能有效篩選出能用于篩選出對(duì)LOXL1蛋白的表達(dá)水平或活性有效促進(jìn)作用的物質(zhì)的問(wèn)題。本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案如下：一種藥物篩選方法，用于篩選出對(duì)LOXL1基因表達(dá)有促進(jìn)作用的物質(zhì)，其中，所述藥物篩選方法中，包括以下步驟：?A、構(gòu)建由人LOXL1基因啟動(dòng)子控制表達(dá)ZsGreen的二代慢病毒載體：將人LOXL1基因啟動(dòng)子片段克隆到慢病毒載體pLVX-ZsGreen上，并將慢病毒載體pLVX-ZsGreen上原有的CMV啟動(dòng)子置換下來(lái)，得到二代慢病毒載體pLenti-PLOXL1-ZsGreen，所述二代慢病毒載體pLenti-PLOXL1-ZsGreen含有由人LOXL1基因啟動(dòng)子控制表達(dá)ZsGreen的元件PLOXL1-ZsGreen；B、用二代慢病毒載體感染人成纖維細(xì)胞，構(gòu)建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纖維細(xì)胞；C、藥物篩選：將所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纖維細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，貼壁過(guò)夜；將待測(cè)物質(zhì)溶解于DMSO中并加入到人成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中；經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，檢測(cè)人成纖維細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度，通過(guò)檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度是否增加來(lái)判斷待測(cè)物質(zhì)對(duì)LOXL1基因表達(dá)的促進(jìn)作用。所述的藥物篩選方法，其中，所述步驟B的具體過(guò)程為：將二代慢病毒包裝體系包裝并濃縮成滴度不低于1x107/ml?的病毒顆粒，按1：100?稀釋?zhuān)糜诟腥炯?xì)胞密度為20%的人成纖維細(xì)胞，經(jīng)流式分選儀篩選出穩(wěn)定整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纖維細(xì)胞系。所述的藥物篩選方法，其中，所述步驟C中，所述待測(cè)物質(zhì)是以0.2-2?mg/ml溶解于DMSO中；所述細(xì)胞培養(yǎng)基中待測(cè)物質(zhì)的最終濃度為1-10?μg/ml。一種用于促進(jìn)胞外基質(zhì)交聯(lián)的藥物，其中，所述藥物中包含有對(duì)LOXL1基因表達(dá)有促進(jìn)作用的物質(zhì)，所述物質(zhì)為采用如上所述的藥物篩選方法篩選所得。所述的用于促進(jìn)胞外基質(zhì)交聯(lián)的藥物，其中，所述藥物包括蘄蛇、大青葉、三尖杉、白芥子、白術(shù)、甘草、瓜萎、冬瓜皮、桑葚、米召、白前、馬勃、月季花、兒茶、玫瑰、生地、澤蘭、黃柏、老鴰草、藿香、佩蘭、芥子、益母草、茺蔚、木蝴蝶、防己、五味子、刺葵藜、川貝、土茯苓、王木留、郁金、紅景天或大黃素中的一種或多種。一種如上所述的用于促進(jìn)胞外基質(zhì)交聯(lián)的藥物的應(yīng)用，其中，將所述用于促進(jìn)胞外基質(zhì)交聯(lián)的藥物用作化妝品添加劑、食品添加劑，或用于制備治療或改善因動(dòng)態(tài)結(jié)締組織病變所致的疾病的藥物。有益效果：本專(zhuān)利技術(shù)中提供了一種能用于篩選對(duì)人LOXL1啟動(dòng)子的活性和LOXL1的表達(dá)量有促進(jìn)的藥物的方法，此方法操作簡(jiǎn)單，而且本專(zhuān)利技術(shù)還具有廣泛的適用性。本專(zhuān)利技術(shù)中通過(guò)對(duì)上千個(gè)中藥提取物及化學(xué)小分子的篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列能提高衰老的人成體細(xì)胞中LOXL1水平的中草藥抽提物及小分子。這些物質(zhì)都能有效地促進(jìn)人LOXL1啟動(dòng)子的活性和LOXL1的表達(dá)量，從而促進(jìn)胞外基質(zhì)蛋白的交聯(lián)，胞外基質(zhì)蛋白包括但不局限于彈性蛋白和膠原蛋白。因此，可將所述用于促進(jìn)胞外基質(zhì)交聯(lián)的藥物用作化妝品添加劑、食品添加劑，或用于制備治療或改善因動(dòng)態(tài)結(jié)締組織病變所致的疾病的藥物。附圖說(shuō)明圖1為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例1中人LOXL1基因啟動(dòng)子的克隆及其活性熒光示蹤成細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建的示意圖。圖2為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例2中加與不加中草藥處理后，ZsGreen熒光強(qiáng)度的檢測(cè)結(jié)果圖。圖3a為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例3中分別加入32種中草藥處理后，ZsGreen熒光強(qiáng)度的檢測(cè)結(jié)果圖。圖3b為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例3中對(duì)數(shù)個(gè)經(jīng)藥物后的細(xì)胞抽提液進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖3c為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例3中對(duì)數(shù)個(gè)經(jīng)藥物后的細(xì)胞抽提液進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖4a為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例4中加與不加大黃素處理后，ZsGreen熒光強(qiáng)度的檢測(cè)結(jié)果圖。圖4b為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例4中加與不加大黃素處理后，細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)結(jié)果圖。圖4c為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例4中用不同濃度的大黃素處理后，，ZsGreen熒光強(qiáng)度的檢測(cè)結(jié)果圖。圖5a1為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例5中加與不加大黃素處理后，人成纖維細(xì)胞系HF1中人LOXL1基因mRNA水平。圖5a2為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例5中加與不加大黃素處理后，人成纖維細(xì)胞系HF1中人LOXL1水平的免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果圖。圖5a3為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例5中用不同濃度的大黃素處理后，人成纖維細(xì)胞系HF1中人Dimer水平的免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果圖。圖5b1為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例5中加與不加大黃素處理后，人成纖維細(xì)胞系HF2中人LOXL1基因mRNA水平。圖5?b?2為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例5中加與不加大黃素處理后，人成纖維細(xì)胞系HF2中人LOXL1水平的免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果圖。圖5?b?3為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例5中用不同濃度的大黃素處理后，人成纖維細(xì)胞系HF2中人Dimer水平的免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果圖。圖6a1為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例6中加不同濃度的大黃素處理后，人成纖維細(xì)胞系HF1中鎖鏈素（Desmosine）水平的免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果圖。圖6a2為本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例6中加不同濃度的大黃素處理后，人成纖維細(xì)胞系HF1中羥基脯氨酸?(Hydroxylp本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種藥物篩選方法，用于篩選出對(duì)LOXL1基因表達(dá)有促進(jìn)作用的物質(zhì)，其特征在于，所述藥物篩選方法中，包括以下步驟：？A、構(gòu)建由人LOXL1基因啟動(dòng)子控制表達(dá)ZsGreen的二代慢病毒載體：將人LOXL1基因啟動(dòng)子片段克隆到慢病毒載體pLVX？IRES？ZsGreen1上，并將慢病毒載體pLVX？ZsGreen上原有的CMV啟動(dòng)子置換下來(lái)，得到二代慢病毒載體pLenti？PLOXL1？ZsGreen，所述二代慢病毒載體pLenti？PLOXL1？ZsGreen含有由人LOXL1基因啟動(dòng)子控制表達(dá)ZsGreen的元件PLOXL1？ZsGreen；B、用二代慢病毒載體感染人成纖維細(xì)胞，構(gòu)建整合有PLOXL1？ZsGreen元件的人成纖維細(xì)胞；C、藥物篩選：將所述整合有PLOXL1？ZsGreen元件的人成纖維細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，貼壁過(guò)夜；將待測(cè)物質(zhì)溶解于DMSO中并加入到人成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中；經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，檢測(cè)人成纖維細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度，通過(guò)檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度是否增加來(lái)判斷待測(cè)物質(zhì)對(duì)LOXL1基因表達(dá)的促進(jìn)作用。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種藥物篩選方法，用于篩選出對(duì)LOXL1基因表達(dá)有促進(jìn)作用的物質(zhì)，其特征在于，所述藥物篩選方法中，包括以下步驟：?
A、構(gòu)建由人LOXL1基因啟動(dòng)子控制表達(dá)ZsGreen的二代慢病毒載體：將人LOXL1基因啟動(dòng)子片段克隆到慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1上，并將慢病毒載體pLVX-ZsGreen上原有的CMV啟動(dòng)子置換下來(lái)，得到二代慢病毒載體pLenti-PLOXL1-ZsGreen，所述二代慢病毒載體pLenti-PLOXL1-ZsGreen含有由人LOXL1基因啟動(dòng)子控制表達(dá)ZsGreen的元件PLOXL1-ZsGreen；
B、用二代慢病毒載體感染人成纖維細(xì)胞，構(gòu)建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纖維細(xì)胞；
C、藥物篩選：將所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纖維細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，貼壁過(guò)夜；將待測(cè)物質(zhì)溶解于DMSO中并加入到人成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中；經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，檢測(cè)人成纖維細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度，通過(guò)檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度是否增加來(lái)判斷待測(cè)物質(zhì)對(duì)LOXL1基因表達(dá)的促進(jìn)作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物篩選方法，其特征在于，所述步驟B的具體過(guò)程為：
將二代慢病毒包裝體系包裝并濃縮成...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉小青，應(yīng)明，蹇麗華，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：上海市第十人民醫(yī)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：