本發(fā)明專利技術提供了一種不基于GC夾板策略的特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，所述特定18SrDNA片段是指包含18SrDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域的片段，以Saccharomycescerevisiae標準菌株NCYC505的18SrDNA序列為參照，所述18SrDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域相當于其起于第1到第30位點范圍內任一核苷酸止于第291位點核苷酸的片段。本發(fā)明專利技術采用特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析無需GC夾板，就可以在相同條件下獲得同帶有GC夾板一致的結果，因此可以節(jié)約實驗成本、減少實驗操作步驟。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及ー種特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，尤其是指ー種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法。
技術介紹
DGGE (變性梯度凝膠電泳)和TGGE (溫度梯度凝膠電泳)是兩種基于DNA片段序列差異的電泳技術，早期常用于基因突變的有效檢測，目前已經(jīng)成為微生物菌群多祥性研究的重要手段。采用這兩項技術可以分離長度相同但序列不同的DNA片段，片段的分離是依靠雙鏈DNA在含有化學變性劑梯度(DGGE)或者溫度梯度(TGGE)的凝膠當中泳動時具有不同的解鏈行為來實現(xiàn)的。為了盡可能有效地檢測序列當中的所有突變，通常在目標片段的 一端加上一段30bp-50bp的高GC片段——由人工合成加在引物的5’端，則經(jīng)過PCR擴增其產(chǎn)物末端就含有該片段；在進行DGGE或者TGGE分析吋，該高GC區(qū)域將使得目標片段在變性梯度環(huán)境中不至于完全解鏈，就可以實現(xiàn)對所有可能的單堿基突變進行檢測，此即GC夾板策略。對于菌群結構研究而言，序列各種單堿基差異的有效識別，將有助于菌群多祥性的準確解析。相關研究表明，對于50_1000bp范圍內的片段如果采用天然序列，DGGE只能檢測所有可能的單堿基突變的50% [V. C. Sheffield, D. R. Cox, L. S. Lerman,R. M. Myers. Attachment of a 40-base-pair G + C-rich sequence (GC-ciamp) togenomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improveddetection of single-base changes [J]. Proc. Natl. Acad. ScL USA . 1989,86:232-236.];而采用GC夾板策略，則可以大大提高DGGE/TGGE的突變檢出率，幾乎可以檢測任何可能的單喊基突變[R. M. Myers, S. G. Fischer, T. Maniatis, et al. Nearlyall single base substitutions in DNA iragnents joined to a bC-clamp can bedetected by denaturing gradient gel electrophoresis [J]. Nucleic Acids Res.1985，13 (9) :3131-3145.]，因此目前該策略已被幾乎所有的DGGE或TGGE相關研究(包括菌群結構研究)所采用。然而在進行菌群結構研究吋，需要同時合成包括含有GC夾板的長引物和不含GC夾板的普通引物兩套引物，尤其是含有GC夾板的長引物通常在60bp以上需要較高的成本，此外有時會出現(xiàn)GC長引物擴增效率降低的情況。事實上，在采用某些特定的DNA片段進行DGGE或TGGE分析吋，GC夾板的有無并不會影響到實驗結果。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術提供了ー種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，凡采用特定18S rDNA片段進行的DGGE/TGGE分析無需GC夾板，就可以獲得同帶有GC夾板一致的結果，可以節(jié)約實驗成本、減少實驗操作步驟。本專利技術解決上述技術問題所采用的技術方案如下ー種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，所述特定18S rDNA片段是指包含18S rDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域的片段，以SaccharomycescereFisiae標準菌株NCYC 505的18S rDNA序列為參照,所述18S rDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域相當于其起于第I到第30位點范圍內任一核苷酸止于第291位點核苷酸的片段。述DGGE/TGGE分析方法包含如下步驟 a、提取所研究樣品的基因組DNA； b、擴增特定18SrDNA片段； C、將步驟b擴增獲得的特定18S rDNA片段進行DGGE或TGGE分析； d、割膠回收目的條帶并采用同樣的引物對片段進行重新擴增；所述同樣的引物即步驟 b中用于擴增特定18S rDNA片段的引物； e、對重擴增的片段進行序列測定，測定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索并根據(jù)結果判定序列所對應菌株的種屬。專利技術采用特定18S rDNA片段進行DGGE分析時，變性劑梯度上限小于40%。本專利技術的顯著優(yōu)點本專利技術提供了ー種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，凡采用特定18S rDNA片段進行的DGGE/TGGE分析無需GC夾板，就可以獲得同帶有GC夾板一致的結果，可以節(jié)約實驗成本、減少實驗操作步驟。附圖說明圖I是18S rDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域示意圖；圖中只展示出18S rDNA片段及與其相鄰的ITS片段，其中黒色區(qū)帶部分表示的是18S rDNA片段，白色區(qū)帶部分表示的是ITS片段，雙箭頭區(qū)域表示的是18S rDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域。圖2是16種真菌的18S rDNA末端區(qū)域的序列比對圖譜；圖中ト16表示16種菌的編號，所代表的種屬詳見表I，圖中NSl表不引物；圖中ruler標識的1-160區(qū)域為低GC含量片段，而160-280區(qū)域含有三個高GC含量片段，分別用三個方框大致標出。引物NSl的靶向位點位于18S rDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域中。雖然收集到的各真菌的18S rDNA序列在遠離ITS序列的末端起始情況不一，但至少起始于第20位點，為了分析方便，部分真菌的18S rDNA序列末端以引物NSl序列補齊，這樣并不會影響到其低GC含量的序列特性。圖3是引物對NSl-fung和NSl-GCfung擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜。圖4是引物對NSl-fung和NSl-GCfung擴增片段的DGGE分析圖譜。圖5是引物對NSl-fung重擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜；重擴增模板為圖4中的20條DGGE條帶的割膠回收液，圖中的字母代表模板在圖4中的標識。具體實施例方式一、本專利技術基于特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析原理 經(jīng)過對目前已知的各主要真菌種屬的18S rDNA序列進行分析發(fā)現(xiàn)，18S rDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域(參見圖I)具有特殊的序列特性其一端含有180bp左右的低GC區(qū)域，相當子 Saccharomyces cereFisiae 標準菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列(Accession Number為Z75578)的1-183位點，其平均GC含量只有35%左右，并且具有極高的可變性；緊鄰低GC區(qū)域的另一端含有三個排列緊湊的高GC區(qū)域,分別相當于Saccharomyces cerevisiae標準菌株NCYC 505 的 18S rDNA序列(Accession Number 為 Z75578)的 184-202位點、223-244位點和268-291位點，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。這樣就導致18SrDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域擁有低熔解區(qū)和高熔解區(qū)，并且兩者之間的熔解本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種不基于GC夾板策略的特定18S?rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，其特征在于：所述特定18S?rDNA片段是指包含18S?rDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域的片段，以Saccharomyces?cerevisiae標準菌株NCYC?505的18S?rDNA序列為參照，所述18S?rDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域相當于其起于第1到第30位點范圍內任一核苷酸止于第291位點核苷酸的片段。
【技術特征摘要】
1.一種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，其特征在于所述特定18S rDNA片段是指包含18S rDNA遠離ITS序列的末端區(qū)域的片段，以Saccharomyces cereFisiae 標準菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列為參照,所述 18S rDNA 遠離ITS序列的末端區(qū)域相當于其起于第I到第30位點范圍內任一核苷酸止于第291位點核苷酸的片段。2.根據(jù)權利要求I所述的一種不基于GC夾板策略的特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，其特征在于所述方法包含如下步驟 a、提取所研究樣品的基因組DNA；...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：倪莉，黃志清，黃山，靳爽，
申請(專利權)人：福州大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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