本發明專利技術公開了一種草莓防褐變專用初代培養基。其以含有0.2-0.5mg/L的6-芐氨基嘌呤（BA）和0.1-0.2mg/L的萘乙酸（NAA）的MS培養基為基本培養基，并加入了濃度為5-15mg/L的抗壞血酸（VC）和0.001-0.5mg/L的油菜素內酯（BR），可大幅度降低草莓組織初代培養過程中的褐變率并提高萌發率。本發明專利技術還公開了利用上述培養基培養草莓莖尖組織生產組培草莓苗的方法，包括草莓苗的取材、消毒、接種和初代培育、繼代培養、馴化及病毒鑒定、網紗大棚內繁殖等步驟。本發明專利技術能有效防止草莓初代培養中褐變現象的產生，初代培養草莓組織中的抗氧化情況有效改善，萌發率從40-60%提升至70%以上。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物組織培養
，特別涉及一種防止草莓組織培養過程中褐變的培養基及利用其組培繁育草莓苗的方法。
技術介紹
草莓是薔薇科草莓屬多年生草本植物，是世界七大水果之一，營養豐富，有“水果皇后”的美稱。另外食用草莓對腸胃病和貧血病有一定的療效，對促進智力發育有重要作用。深受國內外消費者的喜愛。草莓是一種栽培周期短、結果早、見效快的經濟作物，但是草莓的病毒害嚴重影 響草莓的生產。作為高級漿果的草莓，在我國目前的生產栽培上多沿用無性繁殖種苗主要方法是匍匐莖繁殖和分株繁殖，但這兩種方法效率低、種苗易退化、易造成病毒蔓延。王國平(1988)等調查，我國栽培草莓帶病毒植株率過80%以上，戴子林(1995)等調查，我國長江流域感染大面積植株感染率在50%以上，感染了病毒病的草莓結果會存在變小、畸形、品質差、生長緩慢等問題，一般減產30%-80%，并逐年加重；嚴重影響草莓的長勢、品質和產量，對病毒病目前還沒有藥劑可以防治。目前，解決草莓病毒病的主要方法是通過草莓脫毒組培技術來擴繁草莓脫毒苗，使草莓種苗回復品種的優良性狀以達到優質、高產的目的。目前，常見草莓外植體組織培養類型包括草莓莖尖組織培養、草莓葉片和葉柄組織培養、草莓莖段組織培養、草莓花藥培養。草莓組織培養程序一般可分為外植體準備、苗誘導、增殖培養、生根培養、移植馴化等幾個階段，其中在每個階段的培養基選用、溫室條件等對組培苗的繁育系數、脫毒效果、再生率等關鍵參數有著重要影響。其中MS培養基是草莓組培過程中最常用的培養基，即Murashige和Skoog于1962年為煙草細胞培養設計的具備較高無機鹽和離子濃度的穩定培養基，其硝酸鹽含量高、養分的數量和比例合適，能夠保證組織生長所需的礦質營養還能加速愈傷組織的生長，是目前被廣泛應用于植物組織培養快速繁殖的基本培養基。但是，在草莓組織培養中，褐變是影響初代培養褐化和限制初代培養再生率的重要原因，即外植體或培養材料接種后在組織培養過程中，由于切割造成機械損傷，傷口處分泌出酚類化合物，在有氧的條件下，切面細胞中的酚類物質為多酚氧化酶催化，氧化為醌，醌再通過非酶促反應產生有色物質而導致組織褐變，變成棕褐色或暗褐色，并逐漸擴散到培養基中，抑制細胞內其它酶的活性，影響細胞的正常代謝，毒害整個組織，甚至導致組織死亡。中國專利技術專利(申請號201010252871. 4)公開了一套草莓莖尖組培專用的初代培養基、繼代培養基和生根培養基以及用該系列培養基培養草莓莖尖組織生產脫毒苗的方法。其所述的初代培養基是以MS培養基為基本培養基，并在其中添加濃度為O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)，并在初代培養時進行暗培養預防褐化，但其防止褐變的主要手段還是在于減少光照以抑制PPO的活性，防止多酚類物質的氧化，從而減少被培養的組織褐變。但這種技術手段下初代培養的成活率僅從普通的40%左右提升到50-65%，還有提升的空間。王棟等在《植物組織培養中的褐化現象及其防止措施》(黑龍江農業科學2008(1)7 10)中分析了植物組織培養過程中出現褐變的若干因素，并公開了利用吸附劑(有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等)和抗氧化劑(抗壞血酸、硫代硫酸鈉、檸檬酸、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽、蕓香苷、二硫蘇糖醇、酪氨酸、巰基乙醇、卵清蛋白、維生素B、維生素E、有機酸、蛋白質水解產物、氨基酸、亞硫氫酸鈉、氰化鉀、多胺)等用來減少植物組織培養中的褐變現象。其主要原理在于通過吸附組織培養過程中由于切割造成機械損傷處分泌的酚類化合物，或者通過上述抗氧化劑防止擴散到培養基中的酚類化合物被氧化成褐色的醌類物質，從而達到防止褐變的作用。但是，這種方法的不足之處在于只能被動解決擴散到培養基質中的酚類化合物，在實際生產過程中還是會存在較高的褐變現象
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種相對于現有防褐變技術能更有效預防草莓組織培養過程中發生褐變的專用初代培養基。 本專利技術的另一目的在于提供一種再生率高的組培草莓苗生產方法。本專利技術的技術方案是一種能有效預防草莓組織培養過程中發生褐變的專用初代培養基，以O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養基為基本培養基，并在其中添加濃度為5-15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內酯(BR)，其中pH值保持在5. 7-5. 8 ； 上述的草莓防褐變專用初代培養基，其中的抗壞血酸(VC)的濃度為8-12 mg/L,油菜素內酯(BR)的濃度為O. 05-0. 3 mg/L。上述的草莓防褐變專用初代培養基，其中的抗壞血酸(VC)的濃度為10 mg/L，油菜素內酯(BR)的濃度為O.1 mg/L。上述的草莓防褐變專用初代培養基還可以包含有O. 02 mg/L的赤霉素(GA3)和O.3mg/L的激動素(KT)； 上述的草莓防褐變專用初代培養基中O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/L的口引哚乙酸(IAA)來代替。本專利技術的生產方法的技術方案是一種再生率高的組培草莓苗生產方法，其步驟包括1、取材。每年的6-8月，選擇植株生長健壯，匍匐莖充實，尖端生長良好，無病蟲害的優良植株取其莖尖或花藥，作為組織培養的外植體。2、消毒。材料取來修整后用紗布包好放在自來水龍頭下沖洗2-4小時(以莖尖為例)，然后進行表面消毒。先用70%酒精漂洗半分鐘，然后用O. 1%的新潔爾滅浸泡15-20分鐘，再用O. 1%的升汞(氯化汞)消毒5-8分鐘，最后用1-2%的過氧乙酸消毒I分鐘。每次都要用無菌水沖洗3-4次后再進行下一次消毒。整個消毒過程都應在超凈工作臺內完成。3、接種。接種在超凈工作臺內進行，接種前要先用酒精燈對接種用具(鑷子、接種針、接種架等)消毒自然放涼。先用鑷子一層層的剝去莖尖外的幼葉和鱗片，然后在解剖鏡下找到生長點(可帶1-2個葉原基)用接種針挑出生長點(小于O. 5毫米)，放入盛有上述草莓防褐變專用初代培養基的培養瓶內，封好瓶口，置于培養室內培養成小植株。4、室內培養。培養室要求干凈清潔，室內裝有紫外線殺菌燈，每天要對室內進行消毒，以防污染。培養溫度20-28°C，最適溫度25°C，相對濕度70%，光照強度1000-2000勒克斯，每日光照10小時左右。5、繼代培養。每培養25-30天，培養瓶內的小植株就會分出3_5個小植株，把這些小植株分出放于由含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)的MS培養基組成的繼代培養基內培養；過20-30天后又會長出小植株，如此反復進行繼代培養，增加繁殖系數。6、誘導生根。根據生產需要可在1-2月份集中一批苗子生根。草莓試管苗生根很容易，有的在繼代培養基上便可生根。或者在培養基中加入O. 5毫克/升的LBAj^ 30天左右便可長出6-10條長約2-3厘米的小根。7、溫室馴化。把生好根的小苗經光照鍛煉7-10天，從試管內取出，洗凈根部培養基，移栽入土質疏松的沙土摻入少量有機質的營養土內，移栽后要澆透水，支小拱棚覆蓋塑料薄膜保濕。馴化溫度以15-20°C，前兩周空氣相對濕度80-100%，第三周開始短時間放風，放風強度逐漸加大本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種草莓防褐變專用初代培養基，以含有0.2?0.5?mg/L的6?芐氨基嘌呤（BA）和0.1?0.2?mg/L的萘乙酸（NAA）的MS培養基為基本培養基，其特征在于：還含有濃度為5?15?mg/L的抗壞血酸（VC）和0.001?0.5?mg/L的油菜素內酯（BR）。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：畢德，
申請(專利權)人：蘇州和美生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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