本發明專利技術公開了一種具有穿膜功能的hMnSOD-R9及其制備方法與應用，屬于分子生物學與生物化學領域。通過設計引物進行PCR擴增得到引入R9的MnSOD的hMnSOD-R9基因片段，將該片段連接到pET15b構建表達質粒pET15b-hMnSOD-R9，再將該質粒轉化大腸桿菌表達宿主Rosetta-gami得到表達菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9。對該菌株進行誘導表達得到高效可溶的hMnSOD-R9，破碎表達菌體后直接對上清進行純化，極大的簡化生產工藝，降低了成本，解決了SOD工業化生產SOD原料的限制問題。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學與生物化學領域，涉及一種具有穿膜功能的hMnS0D-R9及其制備方法與應用。
技術介紹
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是生物在進化過程中形成的廣泛存在于生物體內的有效清除活性氧的主要金屬酶類之一，它在抗氧化防御中發揮最重要的作用。SOD能夠平衡機體的氧自由基，從而避免當機體內超氧陰離子自由基濃度過高時引起的不良反應，在防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌癥、自身免疫治療等方面顯示出獨特的功能，受到國內外學者和研究者的廣泛關注，研究領域已涉及到化學、生物學、醫學、食品科學和畜牧獸醫學等多個學科。SOD根據其輔基部位結合的不同金屬離子分為4類錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)，鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)，銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和鎳超氧化物歧化酶(N1-SOD)0 MnSOD主要存在于線粒體的基質中。線粒體是細胞的能量工廠，其氧化呼吸鏈的電子傳遞過程中是機體內自由基產生的最主要途徑，所以Mn-SOD是清除02-的第一道防線。MnSOD基因的表達和調控對機體內自由基-自由基清除劑的平衡體系至關重要(HolleyAK, Dhar SK, Xu Y, St Clair DK. Manganese superoxide dismutase:beyond life anddeath. Amino Acids2012, 42:139-158.)。由于Mn-SOD的重要作用，作為藥物酶制劑，具有醫用價值及臨床應用前景，其在疾病的基因治療上有很多報道，如在乳腺癌，口腔癌等方面的應用(Chuang TC, Liu JY, et al. Human manganese superoxide dismutase suppressesHER2/neu-mediated breast cancer malignancy.FEBS Lett2007,581:4443-4449 ；Epperly MW, Wegner R, et al. Effects of MnSOD—plasmidliposome gene therapy onantioxidant levels in irradiated murine oral cavityorthotopic tumors. Radiat Res2007， 167:289-297.)。Mn-SOD的來源主要有以下幾種一是直接從動物和植物體提取，來源豐富，但是提取和純化工藝較復雜。二是利用生物工程基因重組生產，此法生產的SOD重組蛋白由于具有來源穩定、產量高、周期短、工藝簡單、可規模化生產、易純化等優點，得到越來越多的關注。迄今發現的MnSOD大約有30多種，已完成氨基酸序列全分析的MnSOD有近10種。其中通過分子克隆表達的MnSOD種類的有線蟲、弓漿蟲、橡膠樹、蘿卜、桃子、蝦和人等。來源于其他物種的MnSOD對于人體來說具有更大的免疫原性。活性氧主要存在于細胞內，因此開發能透過細胞膜清除細胞內活性氧的SOD具有重要的意義。目前研究已表達的MnSOD都不含有蛋白轉導域(Protein transduction domain, PTD),不能通過細胞膜，因此只能在細胞外起作用，大大限制了其活性的發揮。 以往采用顯微注射法，電穿孔法，脂質體法，病毒載體等方法將生物大分子導入細胞內，對細胞毒性大且效率低。而蛋白轉導域(PTD)是一類能攜帶其他生物大分子(蛋白質，多肽等)穿過多種哺乳動物細胞膜的短肽。常用的高效蛋白質轉導結構域有黑腹果蜆觸足肽(Antenapedia, Antp43_58), HIV-1 反式激活蛋白(Transactivatingprotein, TAT47-57)，單純皰疹病毒轉錄調節蛋白(VP22)和精氨酸富含肽(Arginine-richpeptides)等。精氨酸富含肽蛋白轉導域具有轉膜速度快,轉運效率高的特點,這位將外源性蛋白導入細胞提供了理想手段。研究發現,多聚精氨酸(Polyarginine)型蛋白轉導域是含有九個精氨酸組成的跨膜肽(簡稱R9)，由于其帶有高強度的正電荷，因此能夠迅速與細胞膜結合，通過內吞等方式實現跨膜轉運，有很高的跨膜轉運效率，并且對細胞本身沒有損傷，其穿膜作用不受細胞類型的限制(Fuchs SM, Raines RT. Polyarginine asa multifunctional fusion tag.Protein Sci 2005，14:1538-1544.)。有人曾用基因工程的方法，把pET_22b載體與從念珠藻中克隆的Fe-SOD基因連接構建成pET22b-FeS0D表達載體，并在大腸桿菌中成功表達，得到包涵體形式的融合蛋白(龔興國.pET-SOD工程菌的構建及其表達純化方法[P],中國專利:1962871A; 2007-5-16.)。雖然用基因工程的方法獲得了融合蛋白，但是仍然存在一些問題有待解決。首先FeSOD相對于MnSOD對于活性氧的清除效果稍差。其次其FeSOD基因是從念珠藻中克隆的，表達念珠藻的FeSOD蛋白，對于人體的免疫排斥性較大，不利于以后的在人體上的應用。再次其表達的融合蛋白不含蛋白轉導域，不能通過細胞膜，只能在細胞外起作用，大大限制了其清除活性氧作用的發揮。
技術實現思路
本專利技術的首要目的在于克 服現有技術的缺點與不足，提供一種具有穿膜功能的hMnS0D-R9 (人源錳超氧化物歧化酶)。本專利技術的另一目的在于提供用于制備上述具有穿膜功能的hMnS0D-R9的質粒和菌株。本專利技術的再一目的在于提供在上述具有穿膜功能的hMnS0D-R9的制備方法。本專利技術的目的還在于提供上述具有穿膜功能的hMnS0D_R9的應用。本專利技術的目的通過下述技術方案實現一種具有穿膜功能的hMnS0D-R9，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。編碼上述具有穿膜功能的hMnS0D-R9的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。用于制備上述具有穿膜功能的hMnS0D-R9的質粒pET15b_hMnS0D-R9，由SEQ IDNO. 2所示的核苷酸序列與pET15b質粒構建而成。用于制備上述具有穿膜功能的hMnS0D_R9的菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnS0D-R9,通過將上述質粒pET15b_hMnS0D-R9轉化大腸桿菌表達宿主Rosetta-gami 得到。上述具有穿膜功能的hMnS0D_R9的制備方法，包括如下步驟(l)Rosetta-gami/pET15b-hMnS0D-R9作為表達菌株，基于大腸桿菌表達系統進行誘導表達。(2)收集菌體，用裂解液重懸菌體，冰浴中超聲破碎至溶液澄清，收集上清，用N1-NTA樹脂純化得到hMnS0D-R9。步驟(I)中所述的誘導表達的方法優選為挑取Rosetta-gami/pET15b-hMnS0D-R9單菌落接種于5mL含200mg/mL氨芐青霉素(AMP)的LB培養基于37 °C、220rpm培養過夜；按1:100的比例取2mL培養過夜菌液接種到200mL含200mg/mL AMP的LB培養基37°C、220rpm培養至菌液OD6tltl為O. 5左右時，加入終濃度為O. 5mM的IPTG，于30°本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種具有穿膜功能的hMnSOD?R9，其特征在于：所述的hMnSOD?R9的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種具有穿膜功能的hMnS0D-R9，其特征在于所述的hMnS0D_R9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。2.根據權利要求1所述的hMnS0D-R9，其特征在于編碼所述的hMnS0D_R9的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3.用于制備權利要求1所述的hMnS0D-R9的質粒pET15b_hMnS0D-R9，其特征在于所述的質粒pET15b-hMnS0D-R9由SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列與pET15b質粒構建而成。4.用于制備權利要求1所述的hMnS0D_R9的菌株Rosetta-gami/pET15b_hMnS0D-R9,其特征在于所述的菌株Rosetta-gami/pET15b_hMnS0D-R9通過將權利要求3所述的質粒pET15b-hMnS0D-R9 轉化 Rosetta-gami 得到。5.權利要求1所述的hMnS0D-R9的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)權利要求4所述的菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnS0D-R9作為表達菌株，基于大腸桿菌系統進行誘導表達； (2)收集菌體，用裂解液重懸重懸菌體，冰浴中超聲破碎至溶液澄清，收集上清，用N1-NTA樹脂純化得到hMnS0D-R9。6.根據權利要求5所述的hMnS0D-R9的制備方法，其特征在于 步驟(I)中所述的誘導表達為挑取Rosetta-gami/pET15b_hMnS0D-R9單菌落接種于5mL含200mg...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王峰，張自德，黃璐圓，吳秋紅，張光，李秀英，
申請(專利權)人：暨南大學，
類型：發明
國別省市：
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