一種逆流色譜法分離苦馬豆素的方法技術

本發明專利技術公開了一種逆流色譜法分離苦馬豆素的方法。本發明專利技術以甲基叔丁基醚、正丁醇以及水混合后靜置分層，構成逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系；將固定相以較大流速泵入逆流色譜儀分離柱中；待柱中充滿固定相后，開機，使逆流色譜儀主機以設定轉速轉動，然后以一定流速將流動相泵入分離柱中；待兩相在分離柱中達到動態平衡后，通過進樣閥進樣；自動餾分收集器收集餾分；用薄板層析和高效液相色譜檢測，將含有苦馬豆素成分的餾分合并后回收溶劑，重結晶得到純度大于90％的苦馬豆素本方法簡便快捷，分離效果好，制備量大，樣品損失小，分離成本低，產品純度高，整個分離方法適合于工業化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于天然產物化學領域，涉及一種應用逆流色譜法分離苦馬豆素的方法。
技術介紹
苦馬 豆素(Swainsonine, Sff)是一種大極性的卩引哚里西唳類生物堿,研究表明，苦馬豆素不但具有抑制腫瘤細胞生長和轉移的作用，還能夠刺激機體骨髓細胞的增殖，增強機體免疫力(路浩，等.苦馬豆素抗腫瘤作用研究進展，動物醫學進展，2009，30(9):87-90)。所以近年來苦馬豆素作為一種嶄新的抗癌藥物得到了國內外研究人員的關注，在國外，對苦馬豆素的研究已經進入治療腫瘤的臨床研究階段，而國內對其抗腫瘤活性的研究尚處于起步階段。由于苦馬豆素所具有的特殊的抗腫瘤活性和免疫調節的雙向作用，使其具有潛在的抗腫瘤藥用價值和廣闊的應用前景，因此目前對苦馬豆素提取分離方法的研究也日趨活躍。據文獻報道，目前用于苦馬豆素分離的方法主要為硅膠柱層析法。但柱層析方法分離時間長，樣品有不可逆吸附，回收率低，分離效果差等不足。高速逆流色譜技術是上個世紀80年代出現的一種基于液-液分配色譜的分離新技術。由于它沒有固體載體，所以避免了樣品中目標化合物在固體載體上的不可逆吸附，樣品回收率高，同時還具有操作簡便，分離量大，分離效率高以及重現性好等優點，便于工業化放大生產，已被廣泛用于生物、醫藥、天然產物、環境等各個領域中的分離與制備中。近年來，國內外學者對苦馬豆素的不同提取純化方法進行了有益的探索，中國專利200710017844.7 (—種從瘋草中提取苦馬豆素的新方法)公開了一種從瘋草中提取分離苦馬豆素的方法，即用溶劑反復萃取后得到苦馬豆素粗品，然后用甲醇溶解揮干后升華得到苦馬豆素單體化合物。專利200710017542.X(連續柱層析法提純苦馬豆素的工藝)公開了一種應用連續柱層析法提取苦馬豆素的工藝。中國專利02114590.3(瘋草中苦馬豆素的提純工藝)公開了一種瘋草中苦馬豆素的提純工藝，首先采用陽離子交換法提取出大極性生物堿粗品，再用堿性氯仿抽提，抽提部分經硅膠柱層析分離得到苦馬豆素粗品，最后分步升華獲得苦馬豆素純品。中國專利200610043120.5(綠僵菌發酵提純苦馬豆素的工藝)公開了一種綠僵菌發酵提純苦馬豆素的工藝，即通過生物發酵工程培養，獲得含苦馬豆素較高的菌絲體和發酵液，采用超聲提取、溶劑萃取、薄層色譜、DlOl樹脂、硅膠柱層析及梯度升華等技術，從菌絲體和發酵液中分離提純得到苦馬豆素單體化合物?，F有文獻中未見有應用逆流色譜法分離苦馬豆素單體化合物的報道，因此本專利技術公開一種應用逆流色譜技術分離甘肅棘豆總生物堿提取物中苦馬豆素單體化合物的方法。
技術實現思路
針對上述現有技術中存在的缺陷和不足，本專利技術的目的在于提供一種利用逆流色譜技術分離高純度苦馬豆素的方法。本專利技術實現上述目的的技術方案如下:原料:甘肅棘豆總生物堿。所述的甘肅棘豆總生物堿，系參考專利從甘肅棘豆中提取總生物堿提取物的制備工藝(申請號:200910117752.5)獲得。分離設備:逆流色譜儀。所述的分離設備逆流色譜儀，根據所需目標分離量的不同，可以選擇分析型、半制備型和制備型逆流色譜儀。逆流色譜法苦馬豆素單體的方法，以甲基叔丁基醚、正丁醇以及水混合后靜置分層，構成逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系；將固定相以較大流速泵入逆流色譜儀分離柱中；待柱中充滿固定相后，開機，使逆流色譜儀主機以設定轉速轉動，然后以一定流速將流動相泵入分離柱中；待兩相在分離柱中達到動態平衡后，通過進樣閥進樣；自動餾分收集器收集餾分；用薄板層析和高效液相色譜檢測，將含有苦馬豆素成分的餾分合并后回收溶齊U，重結晶得到苦馬豆素。，其特征在于該方法步驟如下:A分離溶劑系統的選擇由甲基叔丁基醚、正丁醇以及水組成的溶劑體系混合，振搖后靜置分層，將上、下相分開；B將兩相溶劑系統的一相作為固定相，另一相作為流動相；首先將固定相充滿逆流色譜儀的分離柱，然后開動逆流色譜儀主機，達到設定轉速后，向其中泵入流動相，待兩相在分離柱中達到動態平衡后，通過進樣閥將甘肅棘豆總生物堿注入，自動餾分收集器接受懼分；C將收集的餾分通過薄板層析和高效液相色譜檢測，合并含有苦馬豆素的餾分，回收溶劑后重結晶，得到苦馬豆素。本專利技術分離得到的苦馬豆素為白色晶體，純度> 90%。在A步驟中，所用的溶劑體系是指以甲基叔丁基醚、正丁醇和水按照任意體積比混合。在A步驟中，所用溶劑體系的pH值為7-14。在B步驟中，可以以溶劑體系中的上相為固定相，下相為流動相；也可以以溶劑體系中下相為固定相，上相為流動相。在B步驟中，逆流色譜儀可以采用正轉模式，也可以采用反轉模式。在C步驟中，樣品檢測可以采用逆流色譜儀自帶檢測器，也可以使用高效液相色譜，薄板層析或其他檢測手段檢測。本專利技術優點為分離成本低，制備過程安全，并且分離過程能夠連續進行，操作簡單，苦馬豆素產品純度可以達到90%以上。與柱層析等方法比較，它不使用固態的載體，因此不存在固體載體造成的樣品不可逆吸附和損耗，分離效率高，整個分離工藝適合于工業化生產，能夠最大限度的利用原料，降低生產成本，是一種高效快捷的從甘肅棘豆總生物堿提取物中分離苦馬豆素的方法。附圖說明 圖1為甘肅棘豆總生物堿提取物品高效液相色譜圖，從圖中可以看出，總生物堿提取物中除了含有苦馬豆素外還含有大量其他雜質化合物。圖2為逆流色譜分離苦馬豆素單體高效液相色譜圖，從圖中可以看出，分離得到的苦馬豆素產品純度能到90%以上。具體實施例方式下面是本專利技術的實施例，本專利技術包括但不僅限于實施例。實施例1:高速逆流色譜法分離甘肅棘豆總生物堿提取物中的苦馬豆素單體。1.樣品:甘肅棘豆總生物堿，參考專利從甘肅棘豆中提取總生物堿提取物的制備工藝(申請號:200910117752.5)從甘肅棘豆中提取得到。2.儀器:TBE-300B逆流色譜儀，中國上海同田生物技術有限公司。3.制備方法:將甲基叔丁基醚:正丁醇:水按照1: 3: 4(v: V)的比例充分混合均勻，滴加氨水調整PH在9 10后放置在分液漏斗中靜置分層。將上、下相分別放出后超聲20min脫氣，以上相為固定相，下相為流動相。首先將固定相泵入逆流色譜儀螺旋管中，流速20mL/min，·待螺旋管完全充滿固定相后，開啟逆流色譜儀主機，緩慢調整螺旋管轉速至900r/min,同時以lmL/min的流速泵入流動相。當螺旋管尾端流出流動相，系統達到平衡，將400mg前述甘肅棘豆總生物堿樣品溶解在20mL上、下相的混合溶液中，通過進樣閥注入螺旋管中，設置恒溫水浴為25°C，紫外檢測器檢測波長為254nm，自動餾分收集器接樣，4mL為一份，HPLC檢測，合并含有苦馬豆素的餾分，減壓濃縮合并得到苦馬豆素提取物。將苦馬豆素提取物用氯仿-甲醇重結晶得到白色晶體，經過核磁共振、質譜鑒定即為苦馬豆素，測定純度彡90%。實施例2:1.樣品:甘肅棘豆總生物堿，參考專利從甘肅棘豆中提取總生物堿提取物的制備工藝(申請號:200910117752.5)從甘肅棘豆中提取得到。2.儀器:DE HPCCC Spectrum逆流色譜儀,英國DE公司。3.制備方法:甲基叔丁基醚:正丁醇:水按照1: 3: 4(v: V)的比例充分混合均勻，向其中滴加氨水調整PH在9 10后放置在分液漏斗中靜置過夜。將上、下相分別放出后超聲20min脫氣，以上本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種逆流色譜法分離苦馬豆素的方法，其特征在于該方法步驟如下：A分離溶劑系統的選擇由甲基叔丁基醚、正丁醇以及水組成的溶劑體系混合，振搖后靜置分層，將上、下相分開；B將兩相溶劑系統的一相作為固定相，另一相作為流動相；首先將固定相充滿逆流色譜儀的分離柱，然后開動逆流色譜儀主機，達到設定轉速后，向其中泵入流動相，待兩相在分離柱中達到動態平衡后，通過進樣閥將甘肅棘豆總生物堿注入，自動餾分收集器接受餾分；C將收集的餾分通過薄板層析和高效液相色譜檢測，合并含有苦馬豆素的餾分，回收溶劑后重結晶，得到苦馬豆素。

【技術特征摘要】
1.一種逆流色譜法分離苦馬豆素的方法，其特征在于該方法步驟如下: A分離溶劑系統的選擇由甲基叔丁基醚、正丁醇以及水組成的溶劑體系混合，振搖后靜置分層，將上、下相分開； B將兩相溶劑系統的一相作為固定相，另一相作為流動相；首先將固定相充滿逆流色譜儀的分離柱，然后開動逆流色譜儀主機，達到設定轉速后，向其中泵入流動相，待兩相在分離柱中達到動態平衡后，通過進樣閥將甘肅棘豆總生物堿注入，自動餾分收集器接受餾分； C將收集的餾分通過薄板層析和高效液相色譜檢測，合并含有苦馬豆素的餾分，回收溶劑后重結晶，得到苦馬豆素。2.如權利要求1所述的方法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：邸多隆，黃新異，陳小芬，
申請(專利權)人：中國科學院蘭州化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：