一種雙歧桿菌功能基因無痕敲除方法的建立，該建立方法包括構(gòu)建serpin基因自殺型打靶載體UPD；以pDG7為骨架，裝載上雙歧桿菌的啟動子，構(gòu)建雙歧桿菌-大腸桿菌的穿梭表達載體pDG-Hup；在pDG-Hup基礎(chǔ)上構(gòu)建Cre酶基因的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體pDG-hup-cre；將打靶載體轉(zhuǎn)化入雙歧桿菌，通過同源重組得到雙歧桿菌serpin基因缺失株；利用位點特異性重組酶體系Cre-loxp系統(tǒng)，將雙歧桿菌基因組中引入的壯觀霉素spc基因移除，實現(xiàn)了雙歧桿菌抗性基因的無痕敲除。本發(fā)明專利技術(shù)利用同源重組的原理獲得雙歧桿菌功能基因的缺失株，可應用于雙歧桿菌功能基因的敲除，改良菌種。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于雙歧桿菌基因工程中的應用，具體是涉及一種雙歧桿菌功能基因無痕敲除方法。
技術(shù)介紹
基因敲除是利用DNA同源重組原理進行的一種修飾內(nèi)源基因的方式，使外源DNA與受體細胞基因組DNA上的靶基因同源序列之間發(fā)生重組，將外源載體DNA定點整合入靶基因的預定位點上，或與靶基因某一 DNA片段置換，完成對基因組DNA靶基因的精確修飾和改造，造成靶基因的結(jié)構(gòu)或組成的突變，導致基因功能喪失，且經(jīng)修飾和改造的基因能夠隨基因組DNA的復制而穩(wěn)定的復制。它具有定位性強、靶基因敲除后能隨基因組DNA穩(wěn)定遺傳的特點，克服了誘變的隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造微生物遺傳物質(zhì)的方法。在工業(yè)微生物菌種改良中，通過靶基因的敲除改變微生物的代謝途徑和代謝流，不僅能提高發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量和產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物，還能改善發(fā)酵工業(yè)發(fā)酵途徑和過程的人工調(diào)控性，是21世紀最有前景的微生物菌種改良手段。Cre-loxp體系在基因打靶技術(shù)中的應用可以說給基因靶位技術(shù)帶來了一場革命。Cre重組酶是來源于pi噬菌體的重組酶家族的分子量38kd的一種活性蛋白。它不僅具有催化活性，而且跟限制酶相似，識別特異的DNA序列，如=Loxp位點，引起重組。Loxp位點是Cre重組酶作用的特異性重組位點，由34 bp組成，即:ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，兩個13 bp的反向重復順序和8 bp的間隔區(qū)域構(gòu)成。Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀，甚至超螺旋(被Cre重組酶解螺旋成為線形結(jié)構(gòu))。Cre重組酶通過與DNA上Loxp位點的結(jié)合，發(fā)揮其重組作用。Cre/Loxp系統(tǒng)短小精悍、Cre酶作用專一，且不影響基因的正常表達與調(diào)控，這一特點使其在基因打靶操作中有著舉足輕重的作用，目前該系統(tǒng)已成功用于多種真核細胞和細菌的基因敲除。雙歧桿菌能維持宿主腸道的微生態(tài)平衡，提高人體對乳糖耐受性，具有降低血脂、抗腫瘤的作用，并能合成多種維生素，促進機體免疫功能。近年來，國內(nèi)含雙歧桿菌活菌的制劑及食品發(fā)展迅速，雙歧桿菌產(chǎn)品已投入市場。在國外，含雙歧桿菌的食品也十分流行，特別是在日本、歐洲和北美。然而雙歧桿菌作為一種革蘭氏陽性菌，細胞壁較厚，對其進行基因操作一直是個難點，限制了雙歧桿菌基因工程領(lǐng)域的研究進展。本專利技術(shù)通過雙歧桿菌的轉(zhuǎn)化，將打靶載體和穿梭表達載體分步導入雙歧桿菌，并首次將Cre-loxp系統(tǒng)應用于革蘭氏陽性菌雙歧桿菌的基因工程中，成功地實現(xiàn)了雙歧桿菌功能基因的無痕敲除，為研究其基因功能提供了手段。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種雙歧桿菌功能基因無痕敲除方法；該方法首次將Cre-loxp系統(tǒng)應用于革蘭氏陽性菌雙歧桿菌的研究中，得到了雙歧桿菌功能基因無痕缺失株等特點。本專利技術(shù)具體的技術(shù)方案如下: 一種雙歧桿菌功能基因無痕缺失株的建立方法，包括以下步驟: (1)將SEQID.N0.1通過&oR V位點和Pst I酶切連接到pUC57載體上，得到pUC57-LoxP 載體； (2)以pER8質(zhì) 粒為模板，通過引物SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過通ol和々7a I雙切后與pUC57-LoXP載體連接，構(gòu)建得到載體pUC-Spc ； (3)以雙歧桿菌的基因組作為模板，通過引物SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過I和Spe I雙切后與pUC-Spc載體連接，構(gòu)建得到載體pUC-spc-serpinup800 ； (4)以雙歧桿菌的基因組作為模板，通過引物SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過汝711和歷it/III雙切后與pUC-SpC-Serpinup■載體連接，構(gòu)建得到打靶載體質(zhì)粒 pUC-spc-serpinup+dOTn,即 UPD ； (5)SEQ.1D.N0.8序列經(jīng)&oRI和I雙酶切連接至pDG7，構(gòu)建穿梭表達載體pDG-Hup ； (6)以含有Cre酶基因的pCr印A質(zhì)粒為模板，通過引物SEQ.1D.N0.9和SEQ.1D.N0.10擴增Cre酶基因；擴增產(chǎn)物經(jīng)過沿ol和Sal I雙切后，與pDG-Hup連接，構(gòu)建得到 pDG-Hup-Cre ； (7)打靶載體的轉(zhuǎn)化:在雙歧桿菌原生質(zhì)體中加入打靶載體質(zhì)粒pUC-spc-serpinup+d_,融合轉(zhuǎn)化；洗洚、復蘇，復蘇之后將菌液涂布在具有壯觀霉素的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3 d，得到J株； (8)將Jserpin株制成原生質(zhì)體感受態(tài)細胞,將穿梭表達載體pDG-Hup-Cre導入』serpin株，融合轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后菌落涂布在氨芐青霉素抗性的再生培養(yǎng)基上，篩選到不再攜帶壯觀霉素抗性基因的雙歧桿菌serpin基因無痕缺失株J serpin」spc株。步驟(7)和步驟(8)中所述的融合轉(zhuǎn)化的條件為:加入到預熱的含鎂離子濃度為20 ±lmM/L、40±l% (v/v)PEG6000的溶液中，進行融合轉(zhuǎn)化。步驟(7)中，所述雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備為:將保藏的雙歧桿菌轉(zhuǎn)接到MRS平板上，37土1°C厭氧培養(yǎng)20-26 h ;從平板上挑一單菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37±1°C厭氧培養(yǎng)20-26h ;以3±1%&八)的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的1 液體培養(yǎng)基中，37±1 V厭氧培養(yǎng)20-26 h ;離心收集菌體，重懸；加變?nèi)芫刂两K濃度為4.5—5.5 mg/L, 36-38°C酶解25 - 35分鐘；重懸于SMM溶液中，得到雙歧桿菌原生質(zhì)體。優(yōu)選地，所述雙歧桿菌為長雙歧桿菌。本專利技術(shù)的另一目的是提供一種不攜帶壯觀霉素抗性基因的雙歧桿菌功能基因無痕缺失株。優(yōu)選地，所述的雙歧桿菌功能基因無痕缺失株，其是由上述的方法制備得到。 本專利技術(shù)的優(yōu)點是:本方法分步將打靶載體和穿梭表達載體導入雙歧桿菌，利用同源重組的原理，篩選獲得了基因缺失株，導入穿梭表達載體后表達Cre重組酶，移除了抗性基因，從而實現(xiàn)了雙歧桿菌功能基因的無痕敲除，利用這一方法進行基因敲除，最后得到的重組菌不攜帶任何抗性篩選標記，在其使用過程中可以避免抗生素的應用，為雙歧桿菌的菌種改良提供了手段。附圖說明圖1為打靶載體UPD的構(gòu)建示意圖。圖2為重組載體pUC-Spc雙酶切驗證結(jié)果，M:1 K marker; 1: pUC-spc載體；2,3: pUC-spc載體分別用ZAo I, Apa I雙酶切結(jié)果。圖3 為重組載體 pUC-spc_serpinup■雙酶切驗證結(jié)果，M:1 K marker; I, 2:pUC-spc-serpinu_ 載體；3,4，:pUC-spc_serpinup8。。載體分別用及 oR I, 5)% I 雙酶切結(jié)果。圖4為打祀載體pUC-spc-serpinup+dOTn雙酶切驗證電泳結(jié)果，I K marker; 1:口11(:-8口(3-86印;[1115)+(1_載體分別用奴711，歷it/ III雙酶切結(jié)果；2: pUC-spc-serpinup+d_載體分別用Ao I, Hind III雙酶切結(jié)果。圖5為Cre-1oxP系統(tǒng)示意圖。圖6為重組質(zhì)粒pDG-Hup-Cre結(jié)構(gòu)示意圖。圖7為pDG-本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種雙歧桿菌功能基因無痕缺失株的建立方法，其特征是，包括以下步驟：(1)???將SEQ?ID.NO.1通過EcoR?V位點和Pst?I酶切連接到pUC57載體上，得到pUC57?LoxP載體；(2)???以pER8質(zhì)粒為模板，通過引物SEQ.?ID.NO.2和SEQ.?ID.NO.3擴增壯觀霉素抗性基因spc，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過Xho?I和Apa?I雙切后與pUC57?LoxP載體連接，構(gòu)建得到載體pUC?Spc；(3)???以雙歧桿菌的基因組作為模板，通過引物SEQ.?ID.NO.4和SEQ.?ID.NO.5擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過EcoR?I和?Spe?I雙切后與pUC?Spc載體連接，構(gòu)建得到載體pUC?spc?serpinup800；(4)???以雙歧桿菌的基因組作為模板，通過引物SEQ.?ID.NO.6和SEQ.?ID.NO.7擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過Bgl?II和Hind?Ⅲ雙切后與pUC?spc?serpinup800載體連接，構(gòu)建得到打靶載體質(zhì)粒pUC?spc?serpinup+down，即UPD；(5)???SEQ.?ID.NO.8?序列經(jīng)EcoR?I和Sal?I雙酶切連接至pDG7，構(gòu)建穿梭表達載體pDG?Hup；(6)???以含有Cre酶基因的pCrepA質(zhì)粒為模板，通過引物SEQ.?ID.NO.9和SEQ.?ID.NO.10擴增Cre酶基因；擴增產(chǎn)物經(jīng)過Xho?I和Sal?I雙切后，與pDG?Hup連接，構(gòu)建得到pDG?Hup?Cre；(7)???打靶載體的轉(zhuǎn)化：?將打靶載體質(zhì)粒pUC?spc?serpinup+down加入到雙歧桿菌原生質(zhì)體中，融合轉(zhuǎn)化；洗滌、復蘇，復蘇之后將菌液涂布在具有壯觀霉素的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)2?3?d，得到⊿serpin株；(8)???將⊿serpin株制成原生質(zhì)體感受態(tài)細胞，將穿梭表達載體pDG?Hup?Cre導入⊿serpin株，融合轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后菌落涂布在氨芐青霉素抗性的再生培養(yǎng)基上，篩選到不再攜帶壯觀霉素抗性基因的雙歧桿菌serpin基因無痕缺失株⊿serpin⊿spc株。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種雙歧桿菌功能基因無痕缺失株的建立方法，其特征是，包括以下步驟: (1)將SEQ ID.N0.1通過EcoR V位點和Pst I酶切連接到pUC57載體上，得到pUC57-LoxP 載體； (2)以pER8質(zhì)粒為模板，通過引物SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3擴增壯觀霉素抗性基因spc，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過Xho I和Apa I雙切后與pUC57-LoXP載體連接，構(gòu)建得到載體pUC-Spc ； (3)以雙歧桿菌的基因組作為模板，通過引物SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過EcoR I和Spe I雙切后與pUC-Spc載體連接，構(gòu)建得到載體pUC-spc-serpinup800 ；(4)以雙歧桿菌的基因組作為模板，通過引物SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過Bgl II和Hind III雙切后與pUC-SpC-Serpinup8(l(l載體連接，構(gòu)建得到打靶載體質(zhì)粒 pUC-spc-serpinup+d_,即 UPD ； (5)SEQ.1D.N0.8序列經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切連接至pDG7，構(gòu)建穿梭表達載體pDG-Hup ； (6)以含有Cre酶基因的pCr印A質(zhì)粒為模板，通過引物SEQ.1D.N0.9和SEQ.1D.N0.10擴增Cre酶基因；擴增產(chǎn)物經(jīng)過Xho I和Sal I雙切后，與pDG_Hup連接，構(gòu)建得到 pDG-Hup-Cre ； (7)打祀載體的轉(zhuǎn)化:將打祀載體質(zhì)粒pUC-spc-serpinup+d_加入到雙...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：萬翠香，魏華，夏慧玲，許恒毅，章昭琳，
申請(專利權(quán))人：南昌大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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