本發(fā)明專利技術(shù)公開了一株生產(chǎn)1,3-丙二醇的工程菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明專利技術(shù)利用同源重組、基因插入失活的方法使產(chǎn)1,3-丙二醇的野生型菌株中的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因沉默，從而得到乙酸代謝途徑被阻斷的基因工程菌。用本發(fā)明專利技術(shù)的工程菌進(jìn)行1,3-丙二醇的發(fā)酵生產(chǎn)，乙酸生產(chǎn)大幅度降低，使得副產(chǎn)物乙酸對(duì)細(xì)胞的毒害作用大大減少，單位生物量生產(chǎn)速率增強(qiáng)，另外，由于副產(chǎn)物種類減少，也簡(jiǎn)化了后提取工藝，降低了生產(chǎn)成本。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明專利技術(shù)的工程菌按常規(guī)方法發(fā)酵28小時(shí)，1,3-丙二醇濃度可達(dá)55g/L以上。本發(fā)明專利技術(shù)將在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一株生產(chǎn)1，3-丙二醇的工程菌及其構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
:I, 3-丙二醇(PDO)是一種重要的化工原料，可作為有機(jī)溶劑，應(yīng)用于耐壓高潤(rùn)滑齊U、染料、油墨、防凍劑等行業(yè)。PDO可用來(lái)合成雜環(huán)、藥物中間體、聚酯和聚氨酯，尤其是可作為聚酯PTT的單體。PTT是繼50年代聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的新的可成纖聚酯高分子材料，是一種極有發(fā)展前途的新型聚酯材料。1998年P(guān)TT被美國(guó)評(píng)為六大石化新產(chǎn)品之一。PTT與PET、PBT相比除具有聚酯的耐化學(xué)性外，還具有其它一些更優(yōu)良的特性。如尼龍的彈性恢復(fù)性；在全范圍無(wú)需添加特殊化學(xué)藥品即能呈現(xiàn)良好的連續(xù)印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的著色性；抗內(nèi)應(yīng)力；低水吸附、低靜電以及良好的可生物降解性；可循還利用性等。由于PTT的具有以上優(yōu)良特性，它在地毯工業(yè)、服裝材料、工程熱塑料以及其它眾多領(lǐng)域有著很廣泛的應(yīng)用。生產(chǎn)ρττ纖維的關(guān)鍵在于單體原料roo的來(lái)源。ρττ占領(lǐng)市場(chǎng)的關(guān)鍵在于價(jià)格，而ρττ的價(jià)格主要取決于PDo的價(jià)格。由于不能廉價(jià)制得roo，制約了 ρττ的研制和市場(chǎng)開拓。直到90年代中期PDO實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，使得PDO價(jià)格大大降低，PTT才開始工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。Dupont和Shell兩家跨國(guó)公司曾采用化學(xué)合成路線，以環(huán)氧乙烷或丙烯為原料生產(chǎn)roo。化學(xué)合成法生產(chǎn)roo的缺點(diǎn)是副產(chǎn)物多，選擇性和產(chǎn)率較低，操作條件需要高溫高壓，設(shè)備投資巨大，原料不 可再生；同時(shí)由于產(chǎn)量有限，長(zhǎng)期以來(lái)PDO售價(jià)偏高。目前1，3_丙二醇的生產(chǎn)方法主要是微生物發(fā)酵法。與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇具有顯著的優(yōu)點(diǎn):1、利用成本較低的可再生資源(如甘油、玉米、淀粉)為原料；2、生產(chǎn)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，不需貴重金屬催化劑；3、選擇性好，副產(chǎn)物較少，易于分離純化；4、環(huán)境污染小。微生物發(fā)酵法是以生物技術(shù)為特征的“綠色工業(yè)”向傳統(tǒng)石油化工提出的強(qiáng)有力的挑戰(zhàn)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，因而越來(lái)越受到重視。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3_丙二醇是利用微生物歧化甘油產(chǎn)生。至今所有被發(fā)現(xiàn)的1，3-丙二醇生產(chǎn)菌種均為細(xì)菌,其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏朽1檬酸桿菌(Citrobacter freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有較高的 1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化率和1，3-丙二醇生產(chǎn)強(qiáng)度，具有較高的開發(fā)前景，從而得到了較多關(guān)注。目前被用來(lái)生產(chǎn)1，3-丙二醇的克雷伯氏菌主要分離自土壤環(huán)境中。克雷伯氏菌只能利用甘油(不能利用糖類等廉價(jià)碳源)產(chǎn)生1，3-丙二醇。在產(chǎn)生1，3-丙二醇的過(guò)程中，甘油發(fā)生岐化反應(yīng)，氧化途徑中的產(chǎn)物與糖類發(fā)酵產(chǎn)物一致，并產(chǎn)生供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的ATP，在某些產(chǎn)物形成的同時(shí)釋放還原力NADH ;還原途徑則消耗氧化途徑中多余的還原力，生成1，3-丙二醇。氧化途徑中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解為乙酰CoA和甲酸，甲酸往往又會(huì)分解為CO2和H2。乙酰CoA在經(jīng)乙酰磷酸形成乙酸的過(guò)程中生成過(guò)量的ATP，而在經(jīng)乙醛形成乙醇的反應(yīng)中要消耗2摩爾還原力；丙酮酸也可能轉(zhuǎn)化為2，3- 丁二醇，乳酸和琥珀酸，生成乳酸的過(guò)程要消耗I摩爾還原力。而生成琥珀酸的過(guò)程要消耗2摩爾還原力。還原途徑包括兩步反應(yīng):第一步，由依賴于輔酶B12的甘油脫水酶催化甘油脫水生成3-羥基丙醛；第二步，由1，3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基丙醛還原生成1，3-丙二醇，此過(guò)程消耗I摩爾還原力。在克雷伯氏菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇的過(guò)程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到底物甘油和多種產(chǎn)物的抑制作用。在副產(chǎn)物中，以乳酸的產(chǎn)量最多，野生型克雷伯氏菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇的過(guò)程中乳酸產(chǎn)量可達(dá)40g/L以上；副產(chǎn)物乙酸對(duì)發(fā)酵的抑制作用最強(qiáng)烈，6g/L的乙酸即能顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)與發(fā)酵，研究報(bào)道7.6g/L乙酸能減少50%細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中15g/L乙酸可完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。大量副產(chǎn)物的生成不但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，還會(huì)造成底物甘油的浪費(fèi)。例如，由于產(chǎn)生乳酸的途徑會(huì)爭(zhēng)奪還原力，乳酸的產(chǎn)生導(dǎo)致1，3-丙二醇產(chǎn)量降低。由于乙酸的產(chǎn)生，使底物甘油更多地進(jìn)入糖酵解途徑，導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率降低。另外，副廣物的生成，使廣品提取工藝復(fù)雜，能耗成本增加。因此，減少副廣物的生成，對(duì)提聞生廣水平，降低微生物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇成本，具有重要的意義。對(duì)于副產(chǎn)物乳酸，研究報(bào)道敲除乳酸代謝途徑關(guān)鍵編碼基因乳酸脫氫酶基因，可以使乳酸合成大幅度減少，1，3-丙二醇生產(chǎn)能力得到增強(qiáng)。但目前還沒(méi)有失活乙酸代謝途徑關(guān)鍵編碼基因的報(bào)道，乙酸代謝途徑失活對(duì)克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的影響未知
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
:本專利技術(shù)的目的是提供一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的工程菌一敲除乙酸代謝途徑基因的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本專利技術(shù)的敲除乙酸代謝途徑基因的工程菌，是通過(guò)以下方法構(gòu)建的，將產(chǎn)1，3_丙二醇的野生型菌株的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因敲除后獲得的工程菌。所述的1，3-丙二醇的野生型菌株優(yōu)選為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的細(xì)菌，進(jìn)一步優(yōu)選為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。所述的將克雷伯氏菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因敲除，優(yōu)選通過(guò)以下方法敲除:a、PCR擴(kuò)增克雷伯氏菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因的部分同源序列，將其與自殺載體相連，然后再導(dǎo)入雜交供體菌株中；b、將步驟a獲得的攜帶有磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因的部分同源序列與自殺載體的供體菌與克雷伯氏菌進(jìn)行雙親本雜交，利用同源重組、基因插入失活，經(jīng)篩選后獲得磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因被沉默的敲除乙酸代謝途徑基因的克雷伯氏菌。所述的步驟a的PCR擴(kuò)增克雷伯氏菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因的部分同源序列是磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因的哪一部分序列并不重要，只要是同源序列即可。當(dāng)所述的1，3_丙二醇的野生型菌株為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)時(shí),所述的步驟a的PCR擴(kuò)增克雷伯氏菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因的部分同源序列優(yōu)選為是以肺炎克雷伯氏菌的基因組DNA 為模板，以上游引物 PT A-F:TACCCGGGTACCAGCGTAGGTCTGACCAGCGTC 與下游引物 PAT-R:GACCCGGGTTACTTCTGCTGCTGAGCCGATTG組成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列。所述的自殺載體可為自殺載體pGPCm，可從試劑公司購(gòu)買。所述的將攜帶有磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因部分同源序列的自殺載體導(dǎo)入雜交供體菌株中，可以通過(guò)熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法等常規(guī)方法轉(zhuǎn)化雜交供體菌。所述的雜交供體菌可以為大腸桿菌SMlO (Apir)。通過(guò)雙親本雜交，使磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因的部分序列與產(chǎn)1，3-丙二醇的目的菌株發(fā)生同源重組，從而使產(chǎn)1，3-丙二醇的野生型菌株中的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因插入失活，從而獲得敲除乙酸代謝途徑基因的工程菌。本專利技術(shù)還提供了敲除乙酸代謝途徑基因的工程菌在生產(chǎn)1，3_丙二醇中的應(yīng)用。本專利技術(shù)利用同源重組、基因插入失活的方法使產(chǎn)1，3-丙二醇的野生型菌株中的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因沉默，從而得到乙酸代謝途徑被阻斷的基因工程菌。用本專利技術(shù)的工程菌進(jìn)行1，3-丙二醇的發(fā)酵生產(chǎn)，乙酸生產(chǎn)大幅度降低，使得副產(chǎn)物乙酸對(duì)細(xì)胞的毒害作用本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種敲除乙酸代謝途徑基因的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，是將產(chǎn)1，3?丙二醇的野生型菌株的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因敲除后獲得的工程菌。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種敲除乙酸代謝途徑基因的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，是將產(chǎn)1，3-丙二醇的野生型菌株的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因敲除后獲得的工程菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的產(chǎn)1，3_丙二醇的野生型菌株為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的細(xì)菌。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的產(chǎn)1，3_丙二醇的野生型菌株為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的將克雷伯氏菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因敲除，具體通過(guò)以下方法敲除: a、PCR擴(kuò)增克雷伯氏菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因的部分同源序列，將其與自殺載體相連，然后再導(dǎo)入雜交供體菌株中； b、將步驟a獲得的攜帶有磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因的部分同源序列與自殺載體的供體菌與克雷伯氏菌進(jìn)行雙親本雜交，利用同源重組、基因插入失活，經(jīng)篩選后獲得磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因被沉默的敲除乙酸代謝途徑基因的克雷伯氏菌。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，當(dāng)所述的產(chǎn)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周勝，秦啟偉，魏京廣，李莉莉，付靜，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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