一種用于水稻浸種和葉面噴施的殼寡糖的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種可用于水稻浸種和葉面噴施的殼寡糖的方法，該方法是以殼聚糖為原料，利用纖維素酶和殼聚糖酶聯(lián)合酶解制備殼寡糖，本發(fā)明專利技術(shù)方法易于掌握，工藝穩(wěn)定，得到的產(chǎn)品可提高水稻種子發(fā)芽率，增強(qiáng)水稻植株的抗病能力和光合作用效率，水稻產(chǎn)量增產(chǎn)幅度大于10%。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種聯(lián)合酶解生產(chǎn)殼寡糖的方法，屬于生物酶解
具體而言是以殼聚糖為原料，利用纖維素酶和殼聚糖酶制備殼寡糖的方法。
技術(shù)介紹
甲殼素(Chitin)也叫甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)等，存在于蝦蟹等甲殼類動(dòng)物以及昆蟲(chóng)、真菌細(xì)胞壁中等，是地球上僅次于纖維素的第二大有機(jī)物。一百多年來(lái)對(duì)甲殼素的研究，揭示了甲殼素的化學(xué)本質(zhì)和一系列重要作用，并形成以甲殼素為原料生產(chǎn)一系列具有重大經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)業(yè)影響的高技術(shù)產(chǎn)品。殼聚糖是迄今為止發(fā)現(xiàn)的自然界中唯一存在的陽(yáng)離子型可食用纖維，在醫(yī)藥、食品、化妝品和農(nóng)業(yè)等方面都有廣泛且重要的應(yīng)用價(jià)值。甲殼素應(yīng)用領(lǐng)域已拓展到工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)、國(guó)防、人民生活等各方面。由于甲殼素不溶于水，工業(yè)生產(chǎn)上是先將甲殼素轉(zhuǎn)化為殼聚糖，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為具有不同分子量和生物活性及用途的殼寡糖產(chǎn)品。許多研究表明，單糖、二糖生物活性較低，聚合度為4 10的殼寡糖生物活性較高。聚合度為4 6的殼寡糖能夠調(diào)控植物根瘤菌的生成，激活植 物抵抗病原微生物的能力。 現(xiàn)有殼寡糖的制備方法主要有化學(xué)降解法、物理降解法和酶降解法，由于酶降解法可特異性地、選擇性地切斷殼聚糖β -1，4糖苷鍵，降解過(guò)程和降解產(chǎn)物的分子量相對(duì)易于控制，可得到所需分子量范圍的殼寡糖，而且酶法降解是在較溫和的條件下進(jìn)行的，相對(duì)于其他兩種方法，不需加入大量試劑，環(huán)境污染較少。目前已發(fā)現(xiàn)30多種專一性或非專一性酶可用于殼聚糖的降解，專一性酶包括甲殼素酶、殼聚糖酶，非專一性酶包括溶菌酶、蛋白酶、纖維素酶等。然而，現(xiàn)有酶解法制備殼寡糖的制造成本高，產(chǎn)品純度低，嚴(yán)重制約了殼寡糖的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。技術(shù)上的主要問(wèn)題是專一性殼聚糖酶難以獲得，其工業(yè)發(fā)酵單位低，制造成本高:酶解生產(chǎn)I克殼寡糖通常需要消耗50單位左右殼聚糖酶。目前，50單位/mL (或克)殼聚糖酶價(jià)格在500元人民幣左右/千克，每生產(chǎn)I千克殼寡糖，就需要消耗I千毫升或I千克殼聚糖酶，用酶成本在500元人民幣或以上；如果加上殼聚糖原料成本(殼聚糖原料價(jià)格150元人民幣/千克，按照平均酶解轉(zhuǎn)化率50%計(jì)算，生產(chǎn)I千克殼寡糖需要2千克殼聚糖原料)和其他加工費(fèi)用，每千克殼寡糖的制造成本超過(guò)1000元人民幣。如此高的成本和價(jià)格成為市場(chǎng)的主要制約因素；纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等非專一性酶解酶相對(duì)便宜，但可控性差。以纖維素酶為例，其充分酶解(即通過(guò)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，至酶解反應(yīng)自行終止)殼聚糖可獲得轉(zhuǎn)化率較高的低聚合度(3-4個(gè)分子聚合度)殼寡糖產(chǎn)品，并有一定穩(wěn)定性，但卻不能穩(wěn)定獲得其他聚合度的殼寡糖產(chǎn)品，因此，其應(yīng)用有限。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供一種利用非特異性和特異性殼聚糖酶的聯(lián)合作用制備殼寡糖的方法，可用于水稻浸種和葉面噴施，與目前技術(shù)和產(chǎn)品比較，其生產(chǎn)可控性強(qiáng)，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，制造成本明顯下降。本專利技術(shù)的目的將通過(guò)下列詳細(xì)說(shuō)明和描述來(lái)進(jìn)一步闡述。本專利技術(shù)通過(guò)非特異性和特異性殼聚糖酶的聯(lián)合作用，首先利用非特異性酶對(duì)大分子殼聚糖酶進(jìn)行初級(jí)酶解，控制其酶解程度，當(dāng)酶解產(chǎn)物平均分子量在目標(biāo)產(chǎn)物分子量的10倍左右時(shí)，滅酶停止初級(jí)酶解，再利用特異性酶進(jìn)行次級(jí)酶解，當(dāng)?shù)孜镒畲罅哭D(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，滅酶停止二次酶解。本專利技術(shù)的一種聯(lián)合酶解生產(chǎn)可用于水稻浸種和葉面噴施的殼寡糖的方法，是以市售殼聚糖為原料，利用纖維素酶和殼聚糖酶聯(lián)合酶解制備而成，包括下述步驟: a、準(zhǔn)備原料，選擇市售的合格殼聚糖為原料； b、制備殼聚糖膠體溶液，以水為溶劑，并添加乙酸促溶； C、纖維素酶酶解，在殼聚糖膠體溶液中添加纖維素酶，控制溫度、pH進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后加溫滅酶； d、殼聚糖酶接替酶解，在纖維素酶酶解基礎(chǔ)上添加殼聚糖酶，控制溫度、pH進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后加溫滅酶； e、成品處理。所述纖維素酶為利用黑曲霉、里氏木霉或綠色木霉發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶。所述殼聚糖酶為利用sp，枯草芽孢桿菌，短小芽孢桿菌或煙曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的殼聚糖酶。所述殼聚糖膠體溶液的濃 度為1-10%，優(yōu)選為1-4%。更進(jìn)一步地，本專利技術(shù)的用于水稻浸種和葉面噴施殼寡糖制備方法，其工藝步驟如下: I)、備料:以市售殼聚糖為原料，需符合如下質(zhì)量要求: 產(chǎn)品純正，由奸或蟹外殼加工生產(chǎn)而成，殼聚糖含量〉95%(干基)。外觀為白色粉末。脫乙酰度>85%，pH 7.0-8.0，干燥失重〈8.0%，灼燒殘?jiān)?.0%，不溶物〈1.0%，重金屬(以Pb計(jì))^ IOppm,砷< 0.5ppm,菌落總數(shù)< 1000 cfu/g,粒度 40 目-80 目。2)、殼聚糖膠體溶液制備: 制備濃度為1%_4%的殼聚糖水溶液。稱取殼聚糖原料，加入到其質(zhì)量10-20倍的水中(自來(lái)水或純凈水，常溫即可)，靜置溶脹30分鐘后，按照Ig殼聚糖加入濃度為10 mol/L的乙酸溶液I mL的量加入適量乙酸，持續(xù)攪拌至殼聚糖完全溶解，再加水調(diào)整到所需殼聚糖濃度并使用乙酸鈉調(diào)節(jié)PH為3-7。3)、初級(jí)酶解: 將殼聚糖溶液升溫至37°C _55°C，按照每克殼聚糖底物添加10-50單位纖維素酶，酶解溫度37°C _55°C，酶解pH3-7，酶解時(shí)間為3_8小時(shí)。酶解結(jié)束后，升溫至100°C并維持I分鐘，然后迅速冷卻至次級(jí)酶解所需溫度。4)、次級(jí)酶解 經(jīng)過(guò)初級(jí)酶解的殼聚糖酶解溶液，按照每克殼聚糖原料加入5-10單位的殼聚糖酶，維持溫度37°C _55°C，酶解pH3-7，保溫酶解5_10小時(shí)，酶解結(jié)束后，升溫至65°C并維持5分鐘，然后迅速冷卻至室溫。最終酶解產(chǎn)物中2500-3000分子量的產(chǎn)物質(zhì)量占總質(zhì)量的70%或以上。5)成品處理檢驗(yàn)合格的殼寡糖最終酶解液加入防腐劑或適當(dāng)稀釋后加入防腐劑后進(jìn)行灌裝或濃縮后噴霧干燥制成干粉再進(jìn)入檢驗(yàn)、包裝工序。本專利技術(shù)的方法和直接獲得的產(chǎn)品技術(shù)效果顯著，實(shí)現(xiàn)了本專利技術(shù)的目的，目標(biāo)產(chǎn)物含量高，底物轉(zhuǎn)化較徹底，用酶成本低，可控性強(qiáng)，操作容易，大大提高了殼寡糖的質(zhì)量，積極效果主要表現(xiàn)在: 1、目標(biāo)產(chǎn)物含量高，通過(guò)纖維素酶和殼聚糖酶的聯(lián)合酶解，目標(biāo)產(chǎn)物含量達(dá)到70%或以上。2、顯著降低殼寡糖的制造成本，酶成本減少到現(xiàn)有技術(shù)的20%左右，殼聚糖的轉(zhuǎn)化率比現(xiàn)有技術(shù)提高30%左右，總成本下降到現(xiàn)有技術(shù)的25%左右。3、對(duì)水稻增產(chǎn)效果明顯，發(fā)芽率平均提高10%，產(chǎn)量平均提高12%。酶法降解殼聚糖生產(chǎn)殼寡糖產(chǎn)品，不能直接獲得單一酶解產(chǎn)物，無(wú)論哪一種酶，其酶解產(chǎn)物都是不同分子量或聚合度不同的多種分子，只是酶種類的不同和酶解條件的差異，產(chǎn)物分子量分布或集中或分散。如以一種溶菌酶酶解分子量為100萬(wàn)殼聚糖后，其分子量分布如下:分子量I萬(wàn)以上產(chǎn)物質(zhì)量占總質(zhì)量的55%，5000-10000分子量占20%，5000以下分子量占25%,分子量分布比較分散；而以一種纖維素酶充分酶解殼聚糖后，10000分子量占11%，5000-10000分子量占4%，5個(gè)聚合度-5000分子量占15%，4個(gè)聚合度以下產(chǎn)物占70%，分子量分布則比較集中。如果目標(biāo)產(chǎn)物是5000-10000分子量的產(chǎn)物，對(duì)溶菌酶酶解產(chǎn)物就需要通過(guò)分離手段將大于10000分子量和小于5000分子量產(chǎn)物分離出去，目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率為20%，即需要消耗4份殼聚糖原料才能生產(chǎn)I份殼寡糖產(chǎn)品，而對(duì)于纖維素酶解產(chǎn)物，其目標(biāo)產(chǎn)物本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于水稻浸種和葉面噴施的殼寡糖的制備方法，其特征在于，它的工藝步驟包括：a、以殼聚糖為原料；b、制備殼聚糖膠體溶液，以水為溶劑，并添加乙酸促溶；c、纖維素酶酶解，在殼聚糖膠體溶液中添加纖維素酶，控制溫度、pH進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后加溫滅酶；d、殼聚糖酶接替酶解，在纖維素酶酶解基礎(chǔ)上添加殼聚糖酶，控制溫度、pH進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后加溫滅酶；e、成品處理。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：梁運(yùn)祥，蘇一龍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：肇慶長(zhǎng)龍生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：