基于DPO引物檢測布氏桿菌的引物序列及其檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法及其DPO引物序列。選擇布氏桿菌屬（Brucella）Omp25基因為靶基因，通過基因序列的BLAST分析，選取靶基因序列的保守區設計合成雙啟動寡核苷酸引物（DPO)，DPO引物的核苷酸序列為：BO-DPOF：5′-CTTTTGCTGCCGACGCCATCCIIIIIAGGAACAGC-3′，BO-DPOR：5′-TTCGTCGTCCAAGCCGTTGTTAAIIIIIGCTTGATCT-3′，建立DPO-PCR檢測方法，可對布氏桿菌進行精確定性檢測。本發明專利技術還涉及檢測用試劑盒，具有檢測特異性高、準確性高、靈敏度好的優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物檢測
，具體涉及一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的引物序列及其檢測試劑盒。
技術介紹
布氏桿菌屬(份是一類革蘭氏陰性短小桿菌，可感染多種家畜和野生動物，主要引起母畜傳染性流產。同時也可感染人，特別是羊布氏桿菌對人的威脅最大，引起相似的臨床癥狀和病 理損傷，如睪丸炎或附睪炎、不育、生殖器官及胎膜發炎、流產、不孕、關節炎、氣管炎及各種組織的局部病灶等，導致巨大的經濟損失和嚴重的公共衛生問題。現有的布氏桿菌檢測方法:①細菌學檢測，初步分離時，須在59TlO% 二氧化碳環境中才能生長，且待檢樣本中必須存在大量活菌才能被分離出，細菌培養周期長，因此該檢測方法已逐漸被淘汰。②血清學檢測，凝集試驗操作簡便、檢測時間短，但由于IgM在中性或弱酸性時凝集能力最活躍，所以凝集試驗往往因抗體的交叉反應易出現假陽性結果，2000年OIE取消了凝集試驗作為布氏桿菌病的診斷方法；沉淀試驗由于人為進行結果觀察，所以存在判定結果的主觀性，有時會出現誤判，也不是一種理想的檢測方法；補體結合試驗主要用以檢測牛、羊和豬布氏桿菌病，操作中對溫度和試劑滴加量要求高，也無法避免假陽性結果。③變態反應，主要用于山羊和綿羊檢疫，但山羊的變態反應不如綿羊變態反應易判定結果，僅對中、后期病山羊的診斷意義較大，適于山羊布氏桿菌病的篩檢，不作個體的診斷依據。④ELISA方法，競爭ELISA尚無診斷標準，間接ELISA是一種先進、快速、可靠的檢測方法，但存在無法區別疫苗抗體與致病株抗體的不足。⑤PCR方法，是用于細菌DNA檢測最可靠的方法。PCR技術作為一種高度靈敏、快速簡便的檢測方法在諸多領域得到了廣泛應用，尤其在病原體檢測方面取得了革命性的成果，成為核酸快速檢測的金標準，并在此基礎之上，又發展了 DNA探針技術、實時熒光PCR技術和PCR結合變性高效液相色譜(DHPLC)技術等，而PCR引物的設計又成為了制約該類檢測方法成敗的關鍵性因素。常規的PCR引物設計，不僅需要反復比對引物的特異性，而且需要優化引物的各項參數與反應條件，尤其是退火溫度，以防止非特異性擴增，特別是涉及多重PCR時，需要大量的實驗以驗證檢測方法的特異性，費時又費力。雙啟動寡核苷酸引物(Dual priming oligonucleotide, DP0)的設計方法簡化了建立常規PCR方法的操作步驟。該DPO引物的設計分為兩部分，中間用多聚次黃嘌呤肌苷連接，5’ -端長18-25bp，3’ -端長6-15bp。由于該類引物特殊的結構，引物自身以及引物間難形成二級結構且對退火溫度不敏感，試驗過程中不需要對引物進行篩選以及對退火溫度進行優化。同時，DPO引物與模板發生錯配的幾率小，因為只要有3個以上堿基發生錯配，就不會成功擴增，比常規PCR引物的特異性更強，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其檢測結果比常規PCR方法更為精確。在此情況下，采用DPO引物建立DPO-PCR方法對布氏桿菌實施精準檢測，對保障公共衛生安全具有重要意義。本專利技術根據布氏桿菌屬(MruceIla)Qm^靶基因的保守區設計合成了 DPO鑒定引物，通過反應體系與反應條件的優化，建立了布氏桿菌DPO-PCR精準檢測方法。本專利技術可用于臨床病例的快速診斷和流行病學調查，具有一定的實用性。
技術實現思路
基于以上不足之處，本專利技術的目的在于提供一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的引物序列及其檢測試劑盒。本專利技術所采用的技術如下: 一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法檢測用引物對， 上游引物BO-DPOF:如序列表Seq N0.1所示， 下游引物BO-DPOR:如序列表Seq N0.2所示。本專利技術還具有如下特征: 1、一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法制備陽性對照品的PCR擴增引物，上游引物BO-F:如序列表Seq N0.3所示， 下游引物BO-R:如序列表Seq N0.4所示。2、一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法陽性對照品pMD-T_0mp25，如序列表Seq N0.5 所示。3、一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法陽性對照品pMD-T-0mp25的制備方法，包括以下步驟: (1)、PCR模板的制備:布氏桿菌基因組DNA的提取和純化； (2)、選擇布氏桿菌屬(MrucelI a) 0mp25基因作為靶基因，設計陽性對照品的PCR擴增引物:上游引物BO-F，如序列表Seq N0.3所示和下游引物B0-R，如序列表Seq N0.4所示，并進行靶基因的PCR擴增； (3)、陽性對照品pMD-T-0mp25的制備； 步驟(2)中，靶基因的PCR反應體系如下:本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法檢測用引物對，其特征在于，上游引物BO?DPOF：如序列表Seq?No.1所示，下游引物BO?DPOR：如序列表Seq?No.2所示。

【技術特征摘要】
1.一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法檢測用引物對，其特征在于， 上游引物BO-DPOF:如序列表Seq N0.1所示， 下游引物BO-DPOR:如序列表Seq N0.2所示。2.一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法制備陽性對照品的PCR擴增引物，其特征在于， 上游引物BO-F:如序列表Seq N0.3所示， 下游引物BO-R:如序列表Seq N0.4所示。3.一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法陽性對照品pMD-T-0mp25，其特征在于，如序列表Seq N0.5所示。4.根據權利要求3所述的一種基于DPO引物檢測布氏桿菌的PCR方法陽性對照品pMD-T-0mp25的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、PCR模板的制備:布氏桿菌基因組DNA的提取和純化； (2)、選擇布氏桿菌屬(MrucelI a) 0mp25基因作為靶基因，設計陽性對照品的PCR擴增引物:上游引物BO-F，如序列表Seq N0.3所示和下游引物B0-R，如序列表Seq N0.4所示，并進行靶基因的PCR擴增；...

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐義剛，李丹丹，張柏棋，劉忠梅，李蘇龍，
申請(專利權)人：黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：