用于制備抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的重組表達載體制造技術

本發明專利技術涉及一種用于制備抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的重組表達載體。該重組表達載體命名為pYG-Tα1-E2，如序列表SeqNo.1所示。本發明專利技術還涉及一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑，依據豬瘟病毒主要經腸道黏膜感染途徑入侵機體，繼而引發動物疾病，增強機體特異性黏膜免疫，是阻止病原入侵的首要防線，利用乳酸菌作為介導黏膜免疫傳遞疫苗抗原的安全級活菌載體，以豬瘟病毒主要免疫保護性抗原E2蛋白作為免疫原，胸腺肽為免疫增強劑，構建了具有抗豬瘟病毒功能的轉基因乳酸菌制劑。相比于傳統豬瘟疫苗生產具有安全性好、生產成本低、產量高、易于操作的優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及一種用于制備抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的重組表達載體。
技術介紹
豬痕(Classical swine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fevervirus, CSFV)引起豬的一種以急性出血和發熱為主要特征的烈性傳染病，是危害養豬業發展的主要傳染病之一。自然條件下，豬是唯一易感動物，死亡率高，給養豬業造成了巨大的經濟損失。目前CSF的主要流行區有:(1)東南亞疫區，由于控制措施不力，疫情仍然較重；(2)中南美洲疫情穩定區，疫病流行逐年減少；(3)歐洲特別是西歐屬疫情活躍區，雖然采取了嚴密的控制措施，仍經常爆發，是近年來CSF流行的中心。在我國，CSF流行呈現典型和非典型共存、持續感染和隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共存等，疫苗接種仍是防控CSF的主要措施。一些發達國家，如美國、加拿大及一些歐盟成員國等采取嚴格防疫措施和剔除CSF感染豬凈化豬群的方法控制和消滅CSF，成果雖顯著，但經濟損失較大。早期的CSF滅活疫苗因免疫期短、產生免疫保護力慢、生產成本高且繁殖CSF強毒潛在散毒危險等缺陷，自1982年起我國已停止該類疫苗的生產。CSF弱毒疫苗能夠對CSF強毒的攻擊提供保護，在CSF流行的地區，仍是控制該病的重要措施之一。盡管CSF弱毒疫苗能產生有效保護，但在長期免疫接種的脅迫下CSFV可能出現抗原變異，同時CSF細胞弱毒疫苗難以剔除牛病毒性腹瀉病毒的污染，還可能與野毒重組或自然突變而造成毒力返強，并可通過胎盤感染造成胎兒死亡，先天性感染仔豬出現免疫耐受現象。此外，由于CSF弱毒疫苗干擾CSF的血清診斷，難以區分CSF野毒感染豬與免疫豬，同時疫苗保存和使用不當以及疫苗免疫不能覆蓋所有易感豬群，均會導致免疫失敗，而且弱毒苗在接種后至少15d內能夠在淋巴器官(主要是扁桃體)內一定程度的復制，這期間利用標準的診斷方法難以將其與野毒區分開來，不利于鑒別診斷，歐盟已禁止使用CSF弱毒疫苗，而是采用撲殺感染豬和CSF血清陽性豬的措施以控制和消滅CSF。然而采用撲殺政策所需人力、物力和資金巨大，發展中國家更是難以承受，這促使人們研究和開發新型CSF疫苗來防控該病。目前利用反向遺傳學技術改造缺失E2或Erns基因的突變病毒株成為可能，這種缺失突變株只能在反式提供缺失蛋白的感受態細胞系上生長，將其作為疫苗安全性好，但此類疫苗一個值得關注的焦點是突變疫苗株與野毒株之間存在發生重組的可能性。在重組病毒疫苗的研制中，利用CSFV-E2糖蛋白能夠誘導機體產生中和抗體的特性，構建了重組痘苗病毒、腺病毒和偽狂犬病毒等，在臨床上都能夠誘導有效的免疫保護，但所用病毒載體存在生物安全隱患。為了克服CSF弱毒疫苗的固有缺陷，又研發了 CSF亞單位標記疫苗，其中最有效的CSF亞單位疫苗也是基于CSFV-E2糖蛋白研制，疫苗免疫動物后僅產生抗E2蛋白抗體，而野毒感染的豬卻同時能夠產生抗Erns蛋白的抗體，利用現有的ELISA抗體檢測方法能夠加以區分，彌補了經典弱毒疫苗的不足，但是其保護效率還有待于進一步的評估。豬瘟疫苗的設計是多樣的，使我們難以確認哪一種是最好的選擇。在不同的研究中，疫苗劑量、免疫次數、免疫途徑、免疫攻毒之間的時間間隔均不相同，攻毒用的毒株、病毒毒力、攻毒劑量與途徑以及用來評估疫苗效果的標準也不相同。結合豬瘟病毒主要經消化道黏膜系統侵入機體引起動物發病的特點，研制能有效地刺激黏膜免疫系統產生局部免疫應答繼而誘導系統免疫應答的黏膜免疫疫苗，對疫病防治具有重要意義。理想的黏膜疫苗可以促進抗原和免疫系統之間的有效接觸，誘導體液和細胞免疫反應，產生長期的免疫保護作用，且穩定、無毒性。針對基因工程減毒病毒和細菌的應用而帶來的環境和安全問題，發展了以乳酸菌為代表的非致病性活菌載體。乳酸菌作為外源基因表達宿主菌，其優越性主要表現在:①乳酸菌能在呼吸系統、消化系統、泌尿系統定植，對維持微生態平衡具有重要作用不具有致病性，是公認的安全級微生物，易構建成食品級基因克隆及表達系統，有效提高基因工程產品的安全性;③同腸胃外免疫途徑相比，經黏膜免疫，可以誘發IgA產生4免疫方法簡單、安全；⑥具有免疫佐劑作用、固有免疫原性及抗膽汁酸能力。因此，乳酸菌作為免疫接種的口服疫苗載體極具開發潛力。乳酸菌在誘導黏膜免疫應答時或經過小腸上皮的微皺裙細胞(microfold cell, M細胞)，或者通過樹突狀細胞(dendritic cell, DC)進入固有層，激活Th2淋巴細胞，產生白介素IL-5，激活B細胞，分泌IgA，形成黏膜表面抗體slgA，同時可提高免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌，阻止致病微生物的吸附和入侵，而且可將特異性抗原分子攜帶并分泌到腸道，穿過腸壁進入黏膜下層，引起細胞免疫和體液免疫。 因此，本專利技術依據CSFV主要經黏膜感染為出發點，以阻止病原感染的第一道防線為指導思想，利用乳酸菌作為傳遞抗原的載體進行抗CSF基因工程乳酸菌免疫制劑的制備。本專利技術以豬瘟病毒主要免疫保護性抗原E2蛋白作為免疫原，胸腺肽為免疫增強劑，構建了具有抗豬瘟病毒功能的轉基因乳酸菌制劑。實驗證實，本專利技術一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑能有效地刺激黏膜免疫系統產生局部免疫應答，進而引起全身性系統免疫反應，可作為預防豬瘟的口服疫苗。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種具有抗豬瘟病毒感染的轉基因乳酸菌制劑的制備方法。本專利技術根據豬瘟病毒主要經腸道黏膜感染入侵機體的特點，利用常用乳酸菌一保加利亞乳桿菌{Lactobacillus bulgaricus)作為介導黏膜免疫傳遞疫苗抗原的安全級活菌載體，以胸腺肽T α I作為免疫增強劑，豬瘟病毒主要免疫保護性抗原E2蛋白作為免疫原，研發了具有抗豬瘟病毒感染的轉基因乳酸菌制劑，通過口服免疫，可達到預防豬瘟的目的。本專利技術的目的通過下述技術方案實現: 一種用于制備抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌的重組表達載體pYG-Τ α 1-Ε2，如序列表SeqN0.1所示。本專利技術還具有如下特征:1、一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑，其特征在于，將以胸腺肽Tα I作為免疫增強齊U，豬瘟病毒主要免疫保護性抗原Ε2蛋白作為免疫原，構成的重組表達載體pYG-Τα 1-Ε2電轉化入乳酸菌中。本專利技術還具有如下技術特征: 2、一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的制備方法，用于胸腺肽TaI基因PCR擴增引物對， 上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示， 下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示。3、一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的制備方法，用于豬瘟病毒E2蛋白基因PCR擴增引物對， 上引物E-F:如序列表Seq N0.4所示， 下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示。4、一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的制備方法，包括如下步驟: (I)參照Genbank中發布的胸腺肽(Τ α I)基因序列設計PCR引物對，上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示；下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示。(2)根據豬瘟病毒Ε2蛋白基因設計PCR擴增引物對，上引物E-F:如序列表SeqN0.4所示,下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示。(3)進行常規鏈式聚合酶反應分別擴增T α 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于制備抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌的重組表達載體pYG?Tα1?E2，其特征在于，如序列表Seq?No.1所示。

【技術特征摘要】
1.一種用于制備抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌的重組表達載體pYG-Τα 1-E2，其特征在于，如序列表Seq N0.1所示。2.一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑，其特征在于，將以胸腺肽Ta I作為免疫增強齊U，豬瘟病毒主要免疫保護性抗原E2蛋白作為免疫原，構成的重組表達載體pYG-Ta 1-E2電轉化入乳酸菌中。3.根據權利要求2所述的一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的制備方法，用于胸腺肽Tal基因PCR擴增引物對，其特征在于， 上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示， 下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示。4.根據權利要求2所述的一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的制備方法，用于豬瘟病毒E2蛋白基因PCR擴增引物對，其特征在于， 上引物E-F:如序列表Seq N0.4所示， 下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示。5.根據權利要求2所述的一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)、參照Genbank中發布的胸腺肽(Τα I)基因序列設計PCR引物對，上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示；下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示； (2)、根據豬瘟病毒Ε2蛋白基因設計PCR擴增引物對，上引物E-F:如序列表Seq N0.4所示，下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示； (3)、進行常規鏈式聚合酶反應分別擴增Tα I基因及Ε2基因； (4)、構建重組表達載體PYG-Tα 1- Ε2 ； (5)、構建轉基因乳酸菌。6.根據權利要求2所述的一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑，其特征在于，用于預防豬瘟的口服疫苗。7.根據權利要求5所述的一種抗豬瘟病毒轉基因乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)采用常規鏈式聚合酶反應擴增Ta I基因的具體步驟如下:將混合液在70°C加熱5min，25°C退火5min，37°C延伸30m...

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐義剛，李丹丹，劉忠梅，吳巖，李蘇龍，劉新亮，
申請(專利權)人：黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：