本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒或含人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的基因治療產(chǎn)品的熒光絕對(duì)定量PCR試劑盒。所述試劑盒包括以下組分：熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液，特異性引物對(duì)，熒光標(biāo)記的探針和雙蒸水。所述特異性引物對(duì)由SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示的引物組成；所述探針的核苷酸序列為SEQ?ID?No.3所示。本發(fā)明專利技術(shù)設(shè)計(jì)了針對(duì)CMV啟動(dòng)子序列的特異性引物和探針，構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，檢測(cè)線性范圍廣等特點(diǎn)，可以用于人巨細(xì)胞病毒感染的診斷，監(jiān)測(cè)，也可以應(yīng)用含CMV啟動(dòng)子的基因治療產(chǎn)品的通用定量檢測(cè)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子或檢測(cè)含人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒，屬于人巨細(xì)胞病毒或其啟動(dòng)子的檢測(cè)領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
人類巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)的感染對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。HCMV幾乎可以感染所有器官，它的感染一方面使細(xì)胞吞噬溶解功能、抗原呈遞功能、分泌抗病毒細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)因子的功能顯著降低；另一方面通過抑制Th功能或下調(diào)感染細(xì)胞MHC-1類抗原表達(dá)，使被感染個(gè)體免疫功能下降。在感染發(fā)生過程中極早期啟動(dòng)子(major immediate early enhancer/promoter, MIEP)是病毒和宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用的通信接口。人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子能指導(dǎo)基因 在大多數(shù)的體外培養(yǎng)細(xì)胞中瞬時(shí)/穩(wěn)定表達(dá)，是啟動(dòng)真核基因表達(dá)的強(qiáng)力啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子參與構(gòu)建的高效真核表達(dá)載體廣泛應(yīng)用于基因治療產(chǎn)品和DNA疫苗的制備。人巨細(xì)胞病毒感染廣泛存在、發(fā)病率高、危害大，尤其對(duì)于孕產(chǎn)婦、嬰幼兒以及器官移植患者。對(duì)于HCMV感染患者就需要早診斷、早治療，方法選擇顯得很重要。此外，也需要一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的定量檢測(cè)方法用于人巨細(xì)胞病毒(HCMV)基因疫苗的研制及其預(yù)防和治療HCMV原發(fā)和再發(fā)感染效果的評(píng)價(jià)。病毒分離為最準(zhǔn)確方法，是金標(biāo)準(zhǔn)。但耗時(shí)長，技術(shù)要求高，不適合臨床推廣。血清學(xué)檢測(cè)雖然簡(jiǎn)便，但不適于早期檢測(cè)及對(duì)HCMV感染狀況的評(píng)價(jià)。以熒光標(biāo)記探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在目前國內(nèi)的臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛。在探針法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中往往包括一對(duì)或多對(duì)特異性PCR引物及探針，通過研發(fā)過程中的條件摸索，探針及引物只與相對(duì)應(yīng)的模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5 ^端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter，R)，如FAM、VIC、ROX等，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。所以，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長的過程。迄今為止，用于檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒或含有人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒均不同程度的存在特異性差、靈敏度低、檢測(cè)線性范圍較窄等缺陷，有待改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的主要目的是提供一種能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒或檢測(cè)含有人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒，該檢測(cè)試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)的主要目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:—種檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒或檢測(cè)含有人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒，包括以下各組分:熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液，特異性引物對(duì)，熒光標(biāo)記的探針和雙蒸水；所述的特異性引物對(duì)由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物組成；所述的探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。其中，在探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM、HEX或ROX熒光報(bào)告基團(tuán)，優(yōu)選為FAM熒光報(bào)告基團(tuán)；在探針的3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所述的熒光淬滅基團(tuán)可以是TAMRA、BHQ1或BHQ2等熒光淬滅基團(tuán)，優(yōu)選為TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。其中，所述的熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液包括:Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、Mg2+、dNTPs ；為了得到絕對(duì)定量結(jié)果，所述的試劑盒中還包含有人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。所述人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品可通過商業(yè)途徑購買得到，也可參照以下方法構(gòu)建得到:在PUC57質(zhì)粒的Sam I酶切位點(diǎn)插入SEQ ID N0.4所示的基因片段，即得。本專利技術(shù)試劑盒中各組分的用量可根據(jù)待檢測(cè)樣品的數(shù)量以及每次熒光定量PCR反應(yīng)所需的用量來確定或進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，這些都是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員視檢測(cè)情況或?qū)嶋H需要很容易就能確定的參數(shù)。作為參考，采用本專利技術(shù)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒或含有人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的基因治療產(chǎn)品的PCR反應(yīng)條件和PCR反應(yīng)體系如下:PCR反應(yīng)體系:總體積25 μ 1，上/下游引物260nmol/L，探針I(yè)OOnmoI/L, 5XPCR緩沖液5 μ 1，dNTP200 μ mol/L, Mg2+3mmol/L, Ex Taq HS聚合酶1.5U，待檢測(cè)的樣品模板1.5 μ I,滅菌水 16 μ I。PCR 擴(kuò)增條件:94°C 3min ；94°C 30s, 60°C lmin,40 個(gè)循環(huán)。本專利技術(shù)試劑盒可采用各種市售的熒光定量PCR儀進(jìn)行分析和檢測(cè)，所述的熒光定量 PCR 儀可以是 ABI 系列熒光定量 PCR 儀、B10RADiCycler、Roche4800、Qiagen Rotor Gene坐寸ο本專利技術(shù)試劑盒對(duì)檢測(cè)樣本的要求:檢測(cè)樣本來源:人外周血中DNA，動(dòng)物血液和組織臟器中DNA或基因治療產(chǎn)品中的DNA。樣本制備:1、人血液中DNA的提取、動(dòng)物組織臟器中DNA的提取以及基因治療產(chǎn)品中的DNA的提取可以按照市售DNA提取試劑盒說明書操作，也可以按照以下提供的方法操作。2、稱取約25mg左右的組織臟器，去除結(jié)締組織，用剪刀剪成細(xì)小碎塊。加10倍體積 DNA 提取緩沖液[50mM Tris Cl (ρΗ8.0)，0.IM EDTA (ρΗ8.0)，0.IM NaCl]，用超聲勻漿儀進(jìn)行勻漿。取200 μ I勻漿液于2ml的Eppendorf管中，緩慢加入20% SDS溶液，至終濃度I%，搖勻直至溶液變粘稠。再加入5μ I蛋白酶K，55°C消化2-3h或過夜。并間歇攪動(dòng)。或取200 μ I EDTA抗凝的全血或基因治療產(chǎn)品，加入5μ I蛋白酶K，55°C消化2_3h或過夜。 3、取出勻漿液，放置室溫，加入50 μ 15Μ的NaCl至終濃度為1Μ。再加等體積飽和酌.抽提，以12, OOOrpm離心5min。4、取上清加1/2體積飽和酚，1/2體積氯仿/異戊醇抽提一次，以12，OOOrpm離心5min。5、取上清,加等體積氯仿/異戍醇抽提一次，12，OOOrpm離心5min。6、加1/10體積3M NaAcJ^ 2倍體積無水乙醇充分混勻，出現(xiàn)絮狀沉淀，把液體連同沉淀一,決轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12，OOOrpm離心5min,棄廢液。7、加 1111170% 乙醇漂洗，以 12，OOOrpm 離心 5min。8、室溫放置干燥吸附柱后，加100 μ I TE溶解(60°C _70°C預(yù)熱)，室溫放置IOmin后 12，OOOrpm 離心 30sec。-20°C|C存?zhèn)溆谩２捎帽緦＠夹g(shù)試劑盒對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行定量分析的方法可參考以下步驟:1、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算:當(dāng)OD26tl= I時(shí)，相當(dāng)于雙鏈的DNA濃度為50ng/y 1，然后根據(jù)計(jì)算公式:DNA濃度(ng/ μ I) = 50 X OD260 X稀釋倍數(shù),計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度。2、待測(cè)樣品定量:在每次測(cè)定中，用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣本中所得Ct值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的拷貝數(shù)，即為所測(cè)拷貝數(shù)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒或檢測(cè)含人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，包括以下各組分：熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液，特異性引物對(duì)，熒光標(biāo)記的探針和雙蒸水。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒或檢測(cè)含人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，包括以下各組分:熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液，特異性引物對(duì)，熒光標(biāo)記的探針和雙蒸水。2.按照權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述特異性引物對(duì)由SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物組成；所述探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。3.按照權(quán)利要求2所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:在探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)；在探針的3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。4.按照權(quán)利要求3所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的熒光報(bào)告基團(tuán)包括FAM、HEX或ROX熒光報(bào)告基團(tuán)；所述的熒光淬滅基團(tuán)包括TAMRA、BHQ1或BHQ2熒光淬滅基團(tuán)。5.按照權(quán)利要求4所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM熒光報(bào)告基團(tuán)；所述的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。6.按照權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：苗玉發(fā)，李波，沈連忠，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國食品藥品檢定研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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