檢測HIV-1病毒非核苷類抑制劑耐藥突變法及試劑盒制造技術

本發明專利技術涉及檢測HIV-1病毒非核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。本發明專利技術具體公開了檢測人類免疫缺陷病毒非核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，包括以下8類特異性探針中的至少一類：檢測逆轉錄酶基因L100I突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因K103N突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因V106A和V106M突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因V108I突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因Y181C和Y181I突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因Y188L?、Y188H和Y188C突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因G190A突變的特異性探針、檢測逆轉錄酶基因P225H突變的特異性探針。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及檢測Hiv-1病毒非核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。
技術介紹
一、非核苷類逆轉錄酶抑制劑及其作用機制獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmune Deficiency Syndrome, AIDS),又稱艾滋病，是世界十大致命疾病之一，其病原體為HIV-1病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)，HIV屬于逆轉錄病毒，分為HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地區的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染。HIV-1極易產生基因變異，在藥物選擇壓力下形成了大量突變株，使臨床應用的抗HIV藥物迅速喪失臨床效價，對目前的抗HIV治療構成了嚴重的威脅。最早獲準上市的抗HIV藥物是祀向逆轉錄酶(Reverse transcriptase, RT)的核苷類逆轉錄酶抑制劑(Nucleoside RT inhibitors, nRTIs),但是該類藥物具有嚴重的毒副作用。之后上市的非核苷類逆轉錄酶抑制劑(Non-nucleoside RT inhibitors, NNRTIs)具有高效低毒的優點，是目前高效抗逆轉錄療法(Highly active antiretroviral therapy, HAART)的重要組成部分。NNRTIs與核苷類化合物不同，其糖環部分為開鏈結構，因為缺少5’-位羥基，不能進行磷酰化，不參與DNA合成，它們和RT相互作用的機制不同于nRTIs，而是通過與HIV-1RT的非底物結合部位結合，間接影響非底物結合部位的構型，產生抑制活性。HIV-1 RT是由p66/p51亞基組成的異 二聚體酶，其中，p51亞基沒有催化活性，僅具有構象調節作用。p66亞基由聚合酶活性域及RNase H活性域組成，聚合酶活性域由手指、手掌、拇指及鏈接4個亞結構域構成，其功能是以單鏈的病毒RNA為模板將三磷酸脫氧核苷(dNTP)有序地連接起來合成雙鏈DNA。NNRTI是非競爭抑制劑，它與位于RT酶p66亞基手掌亞結構域上的結合位點(NNRTIs binding pocket,NNIBP)的結合引起的RT構象變化,破壞了 DNA聚合酶催化位點的精確結合構象，尤其是β2-β3片層上高度保守的Y183-M184-D185-D186基序。此夕卜，NNRTI的結合扭曲了組成“引物溝”結構元件的活性構象，干擾引物DNA鏈的精確定位，進而抑制DNA的聚合反應。近年來，為克服nRTIs臨床長期應用而引發的毒副作用，非核苷類化合物在治療HIV-1方面得到迅速發展，如奈維雷平、地拉韋定和依非韋侖。二、HIV-1病毒對非核苷類逆轉錄酶抑制劑的耐藥類型及機制NNRTIs長期臨床應用也會產生耐藥性，極大地限制了其臨床應用。進一步研究表明，不同結構類型的NNRTIs所致HIV變異株各不相同，如雙雜芳環呱嗪類化合物表現為HIV-1 RT第100位氨基酸變異產生抗藥性，TIBO類則使其103位氨基酸變異，TSAO類又表現為138位氨基酸變異產生抗藥性，雙吡啶類會引起第106位氨基酸發生變化，吡啶酮類抗藥部位在181位。而HEPT類化合物的耐藥株病毒主要表現在第100位的亮氨酸變異為異亮氨酸，103位的賴氨酸變異為天門冬氨酸，106位的纈氨酸變異為組氨酸。NNRTIs在臨床使用時，NNIBP中單個氨基酸的突變直接影響藥物的結合，經自然選擇后，迅速出現耐藥毒株。主要的NNRTI耐藥突變有K103N/S、V106A/M、Y181C/L/V、Y188L/C/H 和 G190A/S/E ;次要的 NNRTI 耐藥突變有 L1001、K101P、P225H、F227L、M230L和K238T，常常與I個主要NNRTI耐藥突變聯合出現。對第一代NNRTI耐藥的變異株包括L1001、K103N、V106A、E138K、Y188I/C和Y188H,這些變異都位于NNIBP的內部或者周圍。例如:(I)與NVP耐藥性有關的Y181C、G190A和K103N突變;(2)與EFV耐藥性有關的K103N突變；(3)與DLV突變有關的Y181C和K103N突變。此外，其他突變如T215Y/F、M41L、L210W、H208Y和Vl 181等也會使NNRTI產生耐藥。其中，K103N、Y181C和G190A/S是最為嚴重的變異株，能使絕大多數NNRTI產生嚴重耐藥。另外，NNRTI之間也普遍存在交叉耐藥性。通過對大量RT/NNRTI復合物的X衍射晶體學研究，并結合臨床及生物化學相關數據，發現HIV-1變異株對NNRTI產生耐藥性的分子機制包括以下三種:(a)氨基酸突變使RT/NNRTI之間關鍵性疏水性作用缺失或改變；(b)氨基酸突變產生對RT/NNRTI結合不利的立體位阻；(c)氨基酸變異引起的結合位點電荷分布及氫鍵作用的改變。Y181或Y188突變成非芳香性的疏水氨基酸(通常為Y181C和Y188L)，降低NNRTIs結合所需要的芳香性作用，這種芳香作用在第一代NNRTI與RT的結合中占有重要地位，因此Y181C和Y188L變異株會使第一代中許多類型的NNRTIs產生耐藥。其他變異如V106A、F227L和Y318F也會導致第二代NNRTIs疏水性作 用的缺失或改變，進而降低NNRTI與酶的親和力。V106A變異通過改變周圍氨基酸的位置及構象，從而間接影響NNRTIs的結合。NNIBP 中的 A98G、L1001、V1081、G190A/E、P225H、P236L 及 L234I 變異通過增加立體位阻直接或間接擾動周圍的氨基酸來影響NNRTI與RT的結合。第三種耐藥機制與K101E、K103N/T、E138K、V179D、E233V 及 K238T 變異有關。HAART的首要目標是最大限度地、持久地抑制病人體內病毒復制。但是，在實際臨床治療當中，部分病人達不到這樣的效果，即使在初始治療時能有效提升cd4+t細胞數量并顯著降低血漿病毒載量的病人中，仍有相當一部分在持續治療一段時間后血漿病毒載量出現反彈。這就意味著抗病毒治療的失敗。導致抗病毒治療失敗的原因是多方面的，其中HIV-1耐藥性的產生是主要因素之一。目前，廣泛應用于臨床的幾類抗病毒藥物均有耐藥株產生，HIV-1耐藥株的傳播已呈現上升的趨勢，而且HIV病毒株常常會對同一類藥當中的不同種藥物產生交叉耐藥性。耐藥成為AIDS治療面臨的嚴峻挑戰，同時耐藥性檢測逐漸成為幫助臨床醫生選擇聯合用藥方案的重要工具。三、HIV-1病毒的耐藥檢測方法目前HIV-1病毒耐藥性的檢測有兩種方法，即表型檢測及基因型檢測。表型檢測通過用藥期間的病毒培養進行，而基因型檢測則通過分子生物學方法檢測與耐藥性相關的病毒基因突變。基因型檢測的方法有直接測序法、異源雙鏈軌跡試驗(HTA)、PCR連續酶測定試驗、線性探針試驗、限制性內切酶酶切試驗、引物特異的PCR測定、RNA酶(RNase)A錯配剪切試驗等，其中部分技術已有商用系統。在進行基因測序后，將測序結果與標準病毒株比較后可坦福大學耐藥數據庫(http://hivdb.Stanford, edu/)及Los Alamos HIV耐藥數據庫。通過輸入所測得的序列，數據庫可自動提供病毒基因變異及耐藥結果。目前已有基于測序技術的商品本文檔來自技高網...

【技術保護點】
檢測人類免疫缺陷病毒非核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特征是：包括以下8類特異性探針中的至少一類：檢測逆轉錄酶基因L100I突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:1~6中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因K103N突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:7~12中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因V106A和V106M突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:13~21中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因V108I突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:22~27中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因Y181C和Y181I突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:28~36中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因Y188L?、Y188H和Y188C突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:37~50中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因G190A突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:51~56中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉錄酶基因P225H突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:57~65中的任意一種或任意一種的互補序列。...

【技術特征摘要】
1.檢測人類免疫缺陷病毒非核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特征是:包括以下8類特異性探針中的至少一類: 檢測逆轉錄酶基因LlOOI突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 1 6中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因K103N突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 7 12中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因V106A和V106M突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 13 21中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因V108I突變的特異性探針，為SEQ ID NO:22 27中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因Y181C和Y181I突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 28 36中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因Y188L、Y188H和Y188C突變的特異性探針，為SEQ ID NO:37 50中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因G190A突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 51 56中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉錄酶基因P225H突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 57 65中的任意一種或任意一種的互補序列。2.根據權利要求1所述的檢測人類免疫缺陷病毒非核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特征是: 所述檢測逆轉錄酶基因L100I突變的特異性探針中，SEQ ID NO:1 3中的任意一種為針對第100位氨基酸殘基為L的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID ΝΟ:Γ6中的任意一種為針對第100位氨基酸殘基為I的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因Κ103Ν突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 7、中的任意一種為針對第103位氨基酸殘基為K的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 1(Γ 2中的任意一種針對第103位氨基酸殘基為N的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因V106A和V106M突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 13 15中的任意一種為針對第106位氨基酸殘基為V的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 16 18中的任意一種為針對第106位氨基酸殘基為A的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO: 19 21中為針對第106位氨基酸殘基為M的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因V108I突變的特異性探針中，SEQ ID NO:22 24中的任意一種為針對第108位氨基酸殘基為V的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:25 27中的任意一種為針對第108位氨基酸殘基為I的HIV-1逆轉錄酶基因。所述檢測逆轉錄酶基因Y181C和Υ181Ι突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 28 30中的任意一種為針對第181位氨基酸殘基為Y的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID ΝΟ:3Γ33中的任意一種為針對第181位氨基酸殘基為C的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ ID NO:34^36中的任意一種為針對第181位氨基酸殘基為I的HIV-1逆轉錄酶基因； 所述檢測逆轉錄酶基因Y188L、Y188H和Y188C突變的特異性探針中，SEQ IDNO:37 39中的任意一種為針對第188位氨基酸殘基為Y的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ IDNO:40^42中的任意一種為針對第188位氨基酸殘基為L的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ IDNO:43^45中的任意一種為針對第188位氨基酸殘基為H的HIV-1逆轉錄酶基因，SEQ IDNO:46 50中的任意一...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張瓊，李蘭娟，項春生，吳南屏，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：