檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變方法及試劑盒技術

本發(fā)明專利技術涉及檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。具體而言，本發(fā)明專利技術公開了檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，包括檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的探針等等。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及檢測Hiv-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。
技術介紹
一、核苷和核苷類似物類藥物作用機制:人類免疫缺陷病毒(HIV)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，又分為HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地區(qū)的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染，現(xiàn)有藥物主要是抑制HIV-1型病毒的復制。自從1995年開始應用新的抗病毒治療方案，即聯(lián)合使用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的HAART以來，HIV感染的臨床進程被大大改變。這些藥物通過阻斷病毒復制使得免疫系統(tǒng)重建其CD4+T細胞庫并恢復對病原體的免疫力，明顯降低了 HIV/AIDS相關疾病的發(fā)病率和病死率。截至目前，美國FDA已經(jīng)批準了 4大類共26種抗病毒藥物用于艾滋病的臨床治療，其中包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nucleoside reverse transcriptase inhibitor,nRTI)、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)、蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitor，PI)和融合抑制劑(fusion inhibitors)。我國已有5種國產(chǎn)抗病毒藥物進入臨床。在HIV-1的復制循環(huán)中，逆轉(zhuǎn)錄酶在完成RNA指導的DNA合成、RNA水解反應和DNA指導的DNA合成過程中起著十分重要的作用。因此，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶是抗HIV/AIDS藥物設計的一個重要生物靶點。目前市場上出現(xiàn)的以HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點的藥物按作用機制和化學結(jié)構(gòu)可分為核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是最先問世、開發(fā)品種較多的一類藥物，臨床證實對HIV復制具有很強的抑制作用，核 苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nRTIs)，是HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶作用底物脫氧核苷酸的類似物，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活性的三磷酸核苷衍生物，與天然的三磷酸脫氧核苷競爭性與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase, RT)結(jié)合,抑制RT的作用，阻礙前病毒的合成。已上市的nRTIs藥物有:齊多夫定、去輕肌苷、扎西他濱(DDC)、司坦夫定、拉米夫定、阿巴卡韋等。nRTIs的結(jié)構(gòu)與核苷類似，為雙脫氧核苷衍生物，可與細胞內(nèi)核苷競爭性地結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶，從而終止逆轉(zhuǎn)錄反應。通過阻斷病毒RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄，即阻斷病毒的雙股DNA的形成，使病毒失去復制的模板。此類藥物首先進入被感染的細胞，然后磷酸化形成具有活性的雙脫氧核苷三磷酸化合物，競爭性抑制艾滋病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，可導致未成熟的DNA鏈合成終結(jié)，從而病毒復制受到抑制。早期用于治療AIDS及其相關綜合征，對治療HIV陽性/AIDS有一定的效果，可降低死亡率及機會性感染率，但不能治愈AIDS。研究表明，核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑聯(lián)用，副作用大，易出現(xiàn)交叉耐藥。二、HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥類型及機制:隨著我國免費艾滋病抗病毒治療的開展，HIV-1病毒耐藥性的監(jiān)測越來越受到重視。HIV-1病毒耐藥性的產(chǎn)生取決于兩方面:病毒復制過程中的高頻突變和抗病毒藥物產(chǎn)生的選擇壓力。HIV-1是RNA病毒，其基因組由單鏈RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA-DNA復合物，進而反向轉(zhuǎn)錄為前病毒DNA,再由前病毒轉(zhuǎn)錄為病毒基因組RNA,整個過程均由病毒自身的RT催化。因其RT缺乏核酸外切酶活性，對轉(zhuǎn)錄錯誤無校正功能，所以轉(zhuǎn)錄的忠實性差，轉(zhuǎn)錄中的堿基錯配常導致基因突變，因此HIV-1病毒復制過程中表現(xiàn)出很高的突變頻率，每個堿基對在每輪復制中發(fā)生突變的頻率約為3.4X 10_5。另一方面，HIV-1病毒復制迅速，感染初期每天可新形成IO9 101°病毒顆粒。HIV-1病毒的高速復制及復制過程中的高頻突變，導致原發(fā)感染的幾個月內(nèi)就可形成非常大量的基因突變病毒。一旦突變發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶的編碼基因序列，就有可能引起逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶分子發(fā)生改變，導致HIV-1病毒對作用于這兩種酶的抑制劑不再敏感，產(chǎn)生耐藥性。開始抗病毒治療后，野生型病毒被顯著抑制，臨床上可見到病毒載量明顯下降，如果藥物對病毒抑制不完全，與耐藥有關的突變型仍可以持續(xù)復制。在藥物產(chǎn)生的選擇壓力下，耐藥突變型最終取代野生病毒株成為優(yōu)勢群體，臨床上可表現(xiàn)為病毒載量的反彈。核苷和核苷類似物通過抑制RT終止病毒DNA的合成。HIV對這些藥物的耐藥涉及2種不同機制，即破壞這些類似物與DNA結(jié)合以及將其從過早終止的DNA鏈末端移除。RT的多種變異或組合變異可通過選擇性破壞RT而具有將類似物結(jié)合到DNA的能力，導致耐藥產(chǎn)生。主要包括M184V變異、Q151M變異復合體以及K65R變異。M184V、非胸苷類似物突變?nèi)鏚65R和L74V、多核苷耐藥突變Q151M復合體是通過減少nRTI整合至DNA的機制產(chǎn)生耐藥；脫氧胸腺嘧啶核苷類似物突變(TAMs)、與多核苷耐藥相關的T69插入以及許多輔助突變是通過促使nRTIs從DNA水解而產(chǎn)生耐藥。M184V變異即在RT第184位的甲硫氨酸被纈氨酸取代，該變異也是導致病毒對拉米夫定耐藥的主要變異。Q151M復合體在HIV-1中相對較少(在所有對核苷類似物耐藥的HIV-1中所占比例小于5%)，但可導致對大部分而非全部(如拉米夫定和替諾福韋)類似物的耐藥。RT的一組變異可導致核苷類似物從DNA鏈末端被移除，促使對所有核苷和核苷酸類似物的耐藥，其中包括替諾福韋。此類變異是逐漸出現(xiàn)的，且出現(xiàn)的順序也是多變的。TAMs突變可分為兩條通路: 一條與T215Y突變有關(包括M41L、L210W、T215Y和EA4D)，稱為 TAMs-1 ;另一類與 T215F 突變有關(包括 D67N、K70R、T215F 和 K219Q)，稱為 TAMs-1I。研究認為，在TAMs-1通路中，最初出現(xiàn)的突變是T215Y，隨后是M41L和L210W，之后再在此基礎上逐級積累1-3個其他突變密碼子。至于TAMs-1I通路，很多研究認為K70R突變通常是逆轉(zhuǎn)錄酶在AZT治療過程中最先出現(xiàn)的基因突變。三、Hiv-1病毒的耐藥檢測方法:在高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法(highlyactive antiretroviral therapy,HAART)治療中，病毒變異使得治療的敏感性下降，常常導致治療失敗。一些研究顯示，耐藥與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療無效密切相關，對HIV-1耐藥株進行監(jiān)測以指導臨床用藥及預防耐藥株的迅速上升和擴散日顯其重要性。目前已有數(shù)項研究表明，對病人進行耐藥性檢測具有重要臨床應用價值，因而國際艾滋病學會(International AIDS Society-USA)、歐洲AIDS臨床學會(European AIDSClinical Society, EAcs)等幾個專家組,在其AIDS治療指南當中推薦使用HIV耐藥檢測。耐藥成為AIDS治療面臨的嚴峻挑戰(zhàn)，同時耐藥性檢測逐漸成為幫助臨床醫(yī)生選擇聯(lián)合用藥方案的重要工具。目前HIV-1病毒耐藥性檢測有兩種方法，即表型檢測及基因型檢測。表型檢測通過用藥期間的病毒培養(yǎng)進行，而基因型檢測則通過分子生物學方法檢測與耐藥性相關的病毒基因突變。基因型檢測的方法有直接測序法、異源雙鏈軌跡試驗(ΗΤΑ)、PCR連續(xù)酶測定試驗、線性探針試驗、限制性內(nèi)切酶酶切試驗、引物特異的PCR測定、本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特征是：包括以下16類特異性探針中的至少一類：檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:1~9中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:10~17中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:18~23中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:24~29中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:30~39中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:40~45中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:46~51中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:52~57中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:58~63中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:64~69中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:70~75中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Q151M突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:76~81中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M184V和M184I突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:82~90中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L210W突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:91~96中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因T215Y和T215F突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:97~105中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K219Q和K219E突變的特異性探針，為SEQ?ID?NO:106~116中的任意一種或任意一種的互補序列。...

【技術特征摘要】
1.檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特征是:包括以下16類特異性探針中的至少一類: 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 1、中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 1(Γ 7中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 18 23中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 24 29中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 30 39中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的特異性探針，為SEQ ID NO:40 45中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 46 51中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 52 57中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 58 63中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的特異性探針，為SEQ ID Ν0:64 69中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 70 75中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Q151M突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 76 81中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M184V和Μ184Ι突變的特異性探針，為SEQ ID NO:82 90中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L210W突變的特異性探針，為SEQ ID NO:91 96中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Τ215Υ和T215F突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 97 105中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K219Q和Κ219Ε突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 106 116中的任意一種或任意一種的互補序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特征是: 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 1 3中的任意一種為針對第41位氨基酸殘基為M的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 4、中的任意一種為針對第41位氨基酸殘基為L的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 1(Γ 2中的任意一種為針對第62位氨基酸殘基為A的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 13^17中的任意一種為針對第62位氨基酸殘基為V的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 18 20中的任意一種為針對第65位氨基酸殘基為K的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID ΝΟ:2Γ23中的任意一種為針對第65位氨基酸殘基為R的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 24 26中的任意一種為針對第67位氨基酸殘基為D的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 27 29中的任意一種為針對第67位氨基酸殘基為N的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的特異性探針中，SEQ ID ΝΟ:3(Γ32中的任意一種為針對第69位氨基酸殘基為T的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 33 39中的任意一種為針對在第69位氨基酸殘基T后插入SSS、SSA或SSG的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的特異性探針中，SEQ ID ΝΟ:4(Γ42中的任意一種為針對第70位氨基酸殘基為K的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:43^45中的任意一種為針對第70位氨基酸殘基為R的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的特異性探針中，SEQ ID N0:46 48中的任意一種為針對第74位氨基酸殘基為L的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:49^51中的任意一種為針對第74位氨基酸殘基為V的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 52 54中的任意一種為針對第75位氨基酸殘基為V的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 55 57中的任意一種為針對第75位氨基酸殘基為I的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄 酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 58 60中的任意一種為針對第77位氨基酸殘基為F的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID ΝΟ:6Γ63中的任意一種為針對第77位氨基酸殘基為L的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的特異性探針中，SEQ ID Ν0:64 66中的任意一種為針對第115位氨基酸殘基為Y的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:67 69中的任意一種為針對第115位氨基酸殘基為F的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的特異性探針中，S...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張瓊，李蘭娟，項春生，吳南屏，
申請(專利權(quán))人：浙江大學，
類型：發(fā)明
國別省市：