用于分泌性蛋白表達的融合蛋白制造技術

本發明專利技術提供了一種適合于多于一種感興趣多肽（POI）的分泌的融合蛋白，其包括信號肽、POI、包含來自自轉運蛋白的β莖部結構域的載客結構域、以及來自自轉運蛋白的易位蛋白結構域，其中該載客結構域的β莖部形成序列是基本上完整的并且該（這些）POI與該β莖部結構域融合。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于分泌性蛋白表達的融合蛋白
本專利技術總體上涉及一種新的融合蛋白和一種用于分泌性蛋白表達的方法。
技術介紹
分泌性蛋白表達是宿主細胞中蛋白質的表達，其中該蛋白質輸出至細胞膜并且以可溶性方式釋放至培養基中或保持與細胞膜連接。分泌性蛋白表達由處在蛋白質N端的信號肽介導，該信號肽指導多肽到達細胞膜。通常，在原核宿主如大腸桿菌中產生的重組蛋白以胞內方式產生。當蛋白質以這種方式回收時，不得不裂解細胞，這導致重組蛋白被細胞內容物污染。隨后不得不從全細胞提取物中以多步驟純化流程回收蛋白質，這費時并且導致低劣產率。將重組蛋白分泌至培養基中是一項更好的策略，因為從用過的培養基中純化蛋白質較容易并且與連續培養更相容。然而，現有系統不具有高效的產率。其中蛋白質保持與細胞表面連接的分泌性蛋白表達具有其他用途。這種類型的蛋白質表達的用途的實例包括活疫苗開發、表位定位、生物吸附劑和生物傳感器開發和為發現藥物而高通量篩選蛋白質和肽文庫。在表面展示和分泌中，重組蛋白面臨跨過復雜大腸桿菌細胞包膜易位的挑戰，該細胞包膜由兩個脂質膜(內膜和外膜)組成，在其間存在凝膠樣區室(周質)。已經顯示這種易位是十分困難的并且先前使用的方法具有低效力。自轉運蛋白是巨大的蛋白質，它們由革蘭氏陰性細菌如(大腸桿菌)分泌。自轉運蛋白系統在以下意義上是簡單的：認為自轉運蛋白，如其名稱暗示，在蛋白質自身內部攜帶用于跨周質和外膜易位的全部信息。然而，借以自轉運蛋白分泌的機制仍是不完全理解的。自轉運蛋白合成為巨大的前體蛋白，該前體蛋白含有3個主要結構域：(i)將蛋白質靶向Sec易位子并啟動跨內膜轉移的N端信號肽，(ii)包含待分泌的“載貨”蛋白的載客結構域和(iii)包含β桶結構的C端成孔結構域(易位蛋白結構域)，其中該β桶結構整合至外膜中并且在載客結構域跨越外膜易位至胞外空間中發揮關鍵但不清楚的作用。在易位后，載客結構域從易位蛋白結構域中被切下并釋放至胞外環境中。在一些情況下，載客結構域保持與細胞表面非共價地連接。可以通過(外部)蛋白酶對位于易位蛋白結構域和載客結構域之間的蛋白酶基序發揮作用來實現切割。可替代地，切割通過易位蛋白結構域和載客結構域之間特定位點處的分子內自催化事件發生。自轉運蛋白的載客結構域包含β莖部結構和側面結構域。β莖部是由延長的β螺旋形成的伸長結構。載客結構域的C端包含已經參與載客結構域折疊和跨外膜易位的自伴侶結構域。Hbp是屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)絲氨酸蛋白酶自轉運蛋白(SPATE)亞家族的自轉運蛋白。Hbp的載客結構域的晶體結構最近已經測定(Otto等人，2005,J.BiolChem(《生物化學雜志》)280(17)：17339-45)，并且如圖11A顯示。該結構展示這種多肽形成長的右手β-螺旋結構(“β莖部”)。Hbp的載客結構域包含兩個較大的側面結構域：結構域d1和結構域d2，其中d1包含該蛋白質的絲氨酸蛋白酶活并且d2具有未知的功能。還存在3個較小的側面結構域：結構域3(d3)、結構域4(d4)和結構域5(d5)。還已經顯示了其他自轉運蛋白如百日咳桿菌粘著素(Emsley等人，1996Nature(《自然》)381：90-92)和IgA蛋白酶(Johnson等人，2009JMolBiol(《分子生物學雜志》)389(3)：559-74)的相似β莖部結構域。先前已經嘗試使用自轉運蛋白用于大腸桿菌中的分泌性蛋白表達，大多使用經工程化用于表面展示目的的奈瑟氏菌IgA蛋白酶(Pyo等人，2009Vaccine(《疫苗》)272030-2036)和內源性大腸桿菌自轉運蛋白AIDA-I(VanGerven等人，2009Microbiology(《微生物學》)155:468-476)的變體。使用IgA蛋白酶和AIDA-I用于分泌重組蛋白的嘗試使用了導致分泌和表面暴露的蛋白質的低劣產率的構建體(Pyo等人，2009Vaccine(《疫苗》)272030-2036；VanGerven等人，2009Microbiology(《微生物學》)155:468-476)。在大多數的這類研究中，完整或幾乎完整的內源性載客結構域由重組蛋白替換。迄今，自轉運蛋白已經主要用作展示平臺，而非用于可溶性形式的異源蛋白質的分泌，其中該蛋白質被分泌至培養基中。IgA蛋白酶需要附屬蛋白酶用于加工，而AIDA-I在切割后保持與外膜非共價地連接。因此，這些自轉運蛋白可能僅用于表位和蛋白質的表面呈遞。先前已經顯示了與Hbp載客結構域融合的鈣調蛋白的高效展示和分泌(Jong等人，2007MolecularMicrobiology(《分子微生物學》)63:1524-1536)。為了最小化對載客結構域的天然β-莖部的擾動，鈣調蛋白替換Hbp載客結構域的結構域2。對于某些應用，從細胞表面分泌或展示多于一種感興趣蛋白(POI)的可能性是十分有用的。這類應用包括疫苗，例如其中兩個或更多個表位展示在相同的細胞表面上；酶展示，其中多于一個酶展示在細胞表面上來以一系列步驟實施眾多催化反應；肽文庫暴露和抑制劑篩選。對于多價疫苗，特別有用的是具有一種系統，其中一個宿主細胞群體可以表達并展示或分泌多種抗原，而非具有細胞群體的混合物，每個群體僅展示或分泌這些抗原之一。僅具有展示或分泌多種抗原的一個細胞群體具有更易生產和更好控制疫苗含量的優點。總之，需要改進的分泌表達系統，這些系統用于展示異源蛋白質以及將異源蛋白質以可溶性形式分泌至培養基中。也需要的一種系統和一種方法，其能夠在宿主細胞的細胞表面上使多于一個感興趣蛋白進行分泌性蛋白表達或分泌多于一種蛋白質至培養基中。專利技術目的本專利技術的一個目的是提供感興趣多肽(POI)從宿主細胞中的高效分泌。本專利技術的第二目的是提供POI在宿主細胞表面上的高效展示。本專利技術的第三目的是提供POI向其中培養宿主細胞的培養基中的高效可溶性分泌。本專利技術的又一個目的是提供用于多于一種POI的高效分泌(即展示或可溶性分泌)的支架。專利技術簡述在本專利技術的第一方面，提供了能夠表達多于一種(如至少兩種)POI(感興趣蛋白)的宿主細胞。這些POI包含于一種融合蛋白中，該融合蛋白還包含載客結構域(其包含來自自轉運蛋白的β莖部結構域)、來自自轉運蛋白的易位蛋白結構域和能夠將該融合蛋白靶向革蘭氏陰性細菌內膜的信號肽。該載客結構域的β莖部形成序列是基本上完整的并且這些POI與該載客結構域融合。與其他系統相比，用于分泌性蛋白表達的這種宿主細胞具有幾個優點，包括但不限于更高效地分泌多于一種POI。另外，當目標是展示POI時，隨著POI將進一步離開細胞表面并且更穩定，β莖部結構域將能夠實現更高效的展示。在本專利技術的宿主細胞的一個實施例中，自轉運蛋白的天然形式的載客結構域包含從β莖部結構域突出的至少一個側面結構域。POI隨后可以插入、替代或部分替代這種側面結構域。在另一個實施例中，自轉運蛋白的天然形式的載客結構域包含至少兩個側面結構域。每種POI隨后可以插入、替代或部分替代獨立的這種側面結構域，或POI可以插入、替代或部分替代相同的側面結構域。POI也可以與來自自轉運蛋白的獨立的載客結構域、易位蛋白結構域和信號肽融合。在本專利技術的第二方面，提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含多于一種(如本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.09.28 SE 1051000-61.一種能夠表達多于一種感興趣多肽POI的宿主細胞，該宿主細胞是革蘭氏陰性細菌且包含融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含所述POI以及i.一種包含來自屬于pfam自轉運蛋白家族PF03797的自轉運蛋白的β莖部結構域的載客結構域，其中該載客結構域的β莖部形成序列是基本上完整的，所述β莖部形成序列是基本上完整的是指與破壞或完全除去β莖部時相比，蛋白質的分泌功能的效率維持在最佳水平并且也指在分泌后，載客結構域的穩定性得到維持；ii.一種來自屬于pfam自轉運蛋白家族PF03797的自轉運蛋白的易位蛋白結構域；和iii.一種能夠將該融合蛋白靶向革蘭氏陰性細菌內膜的信號肽；其中處于其天然形式的自轉運蛋白的載客結構域包含至少兩個側面結構域，并且其中至少兩種POI插入、替代或部分替代不同的側面結構域。2.根據權利要求1所述的宿主細胞，其中在表達時，該融合蛋白在該細胞表面展示。3.根據權利要求1-2中任一項所述的宿主細胞，其中在表達時，該融合蛋白從該細胞表面分泌并且釋放。4.根據權利要求1-2中任一項所述的宿主細胞，其中i)中的載客結構域和ii)中的易位蛋白結構域源自一種腸桿菌科的絲氨酸蛋白酶自轉運蛋白SPATE。5.根據權利要求所述4的宿主細胞，其中該SPATE蛋白是來自大腸桿菌的血紅蛋白結合蛋白酶Hbp、胞外絲氨酸蛋白酶EspC或溫度敏感性血凝素Tsh。6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其中該SPATE蛋白由序列為SEQIDNO1或SEQIDNO2的多肽組成。7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其中SEQIDNO1或SEQIDNO2的氨基酸53-308、533-608、657-697、735-766和898-922對應于多個側面結構域，并且其中這些POI插入、替代或部分替代至少兩個這類側面結構域。8.一種融合蛋白，其包含i.多于一種感興趣多肽POI；ii.一種包含來自屬于pfam自轉運蛋白家族PF03797的自轉運蛋白的β莖部結構域的載客結構域，其中該載客結構域的β莖部形成序列是基本上完整的，所述β莖部形成序列是基本上完整的是指與破壞或完全除去β莖部時相比，蛋白質的分泌功能的效率維持在最佳水平并且也指在分泌后，載客結構域的穩定性得到維持；iii.一種來自屬于pfam自轉運蛋白家族PF03797的自轉運蛋白的易位蛋白結構域；和iv.可任選地，一種將該融合蛋白靶向革蘭氏陰性細菌內膜的信號肽，其中處于其天然形式的自轉運蛋白的載客結構域包含至少兩個側面結構域，并且其中至少兩種POI替代或部分替代獨立的側面結構域。9.根據權利要求8所述的融合蛋白，其中i)中的載客結構域和ii)中的易位蛋白結構域源自一種腸桿菌科的絲氨酸蛋白酶自轉運蛋白SPATE。10.根據權利要求9所述的融合蛋白，其中該SPATE蛋白是來自大腸桿菌的血紅蛋白結合蛋白酶Hbp、胞外絲氨酸蛋白酶EspC或溫度敏感性血凝素Tsh。11.根據權利要求10所述的融合蛋白，其中該SPATE蛋白由序列為SEQIDNO1或SEQIDNO2的多肽組成。12.根據權利要求11所述的融合蛋白，其中SEQIDNO1或SEQIDNO2的氨基酸53-308、533-608、657-697、735-766和898-922對應于多個側面結構域，并且其中這些POI插入、替代或部分替代至少兩個這類側面結構域。13.一種經安排用于表達融合蛋白的核酸，所述核酸在框內包含：i.編碼所述融合蛋白的信號肽的序列，該信號肽能夠將該融合蛋白靶向革蘭氏陰性細菌的內膜；ii.編碼所述融合蛋白的載客結構域的序列，該載客結構域包含來自屬于pfam自轉運蛋白家族PF03797的自轉運蛋白的β莖部結構域；以及iii.編碼所述融合蛋白的易位蛋白結構域的序列，該易位蛋白結構域源自屬于pfam自轉運蛋白家族PF03797的自轉運蛋白，其中該編碼處于其天然形式的自轉運蛋白的載客結構域的序列包含至少兩段序列，這些序列編碼從該β莖部結構域突出的側面結構域，并且其中該編碼載客結構域的序列包含允許框內地克隆至少兩個編碼感興趣多肽POI的DNA序列的至少兩段克隆位點序列，所述至少兩段克隆位點序列插入、替代或部分地替代所述編碼側面結構域的序列段的獨立段，并且所述克隆位點序列段如此安排，從而該載客結構域的所編碼的β莖部形成蛋白序列是基本上完整的，所述β莖部形成序列是基本上完整的是指與破壞或完全除去β莖部時相比，蛋白質的分泌功能的效率維持在最佳水平并且也指在分泌后，載客結構域的穩定性得到維持。14.一種經安排用于表達融合蛋白的核酸，所述核酸在框內包含：i.編碼所述融合蛋白的信號肽的序列，該信號肽能夠將該融合蛋白靶向革蘭氏陰性細菌的內膜；ii.編碼所述融合蛋白的載客結構域的序列，該載客結構域包含來自屬于pfam自轉運蛋白家族PF03797的自轉運蛋白的β莖部結構域；iii.編碼所述融合蛋白的易位蛋白結構域的序列，該易位蛋白結構域源自屬于pfam自轉運蛋白家族PF03797的自轉運蛋白；和iv.編碼所述融合蛋白的多于一種感興趣多肽POI的序列，其中這些編碼POI的序列與該編碼載客結構域的序列融合并且如此安排，從而該載客結構域的所編碼的β莖部形成蛋白序列是基本上完整的，所述β莖部形成序列是基本上完整的是指與破壞或完全除去β莖部時相比，蛋白質的分泌功能的效率維持在最佳水平并且也指在分泌后，載客結構域的穩定性得到維持，并且其中該編碼處于其天然形式的自轉運蛋白的載客結構域的序列包含至少兩段序列，這些...

【專利技術屬性】
技術研發人員：約恩·路易林克，沃特·S·P·鐘，
申請(專利權)人：阿貝拉生物科學公司，
類型：
國別省市：