作為檢測日光照射、前列腺癌和其它癌癥的診斷工具的線粒體突變及重排制造技術

本發(fā)明專利技術提供了可用于對于檢測癌癥和日光照射的線粒體DNA缺失。具體地，提供了檢測線粒體DNA缺失以用于前列腺癌、日光照射和非黑色素瘤皮膚癌的早期檢測、診斷和發(fā)展的方法和試劑盒。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本申請是申請?zhí)枮?00680021903.1的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請PCT/CA2006/000652的中國國家階段申請。?
本專利技術涉及線粒體基因組學領域。具體地，其涉及線粒體基因組中的突變和重排，及其作為日光照射、衰老和疾病的發(fā)生或存在的指示因子的功用，例如在一般的臨床癥狀顯現(xiàn)之前檢測腫瘤形成前、腫瘤形成以及向潛在惡性轉化的進展。?
技術介紹
當前生物科學中的大趨勢是人類基因組計劃以及該數(shù)據(jù)的商業(yè)開發(fā)。然而，對這些信息的利用和實行存在例外的限制，因為該數(shù)據(jù)在個體水平上不是特異性的。令人難以置信的是，該數(shù)據(jù)僅來自少量個體，難以代表人類種群中存在的變異，從而使得該數(shù)據(jù)只能用于一般應用。人類基因組驚人的復雜性使基于個體基礎的應用并不實際。為了對一個人類細胞核基因組進行完整測序，美國能源部和國立衛(wèi)生研究院從1988年起已投資25億美元(http://www.ornl.gov/hgmis/project/budget.html)。?線粒體基因組?線粒體基因組是緊湊但卻至關重要的核酸序列。線粒體基因組編碼細胞呼吸所必需的酶亞基。與33億bp的龐大核基因組相反，線粒體DNA(或“mtDNA”)是16,569個堿基對(bp)的小核酸基因組(Anderson?等，1981；Andrews等，1999)。其遺傳互補體比其同細胞的核小得多(0.0005％)。然而，個體細胞帶有103至104中任意數(shù)目的線粒體，這取決于特定的細胞功能(Singh?and?Modica-Napolitano2002)。在細胞核和線粒體基因組之間一般存在通訊或化學信號轉導(Sherratt等，1997)。而且，特定的細胞核組分負責線粒體序列的維持和完整性(Croteau等，1999)。當這些細胞核區(qū)域由于指示潛在疾病的細胞核重排而失去功能時，接著?mtDNA序列中也會開始出現(xiàn)突變。另外，可以通過線粒體基因組中由體細胞突變推動的缺失來對細胞內破壞鑒定特異性線粒體。這種理論性機制也可以用于指示將發(fā)生的疾病。線粒體需要約3,000種基因，其中只有37種由線粒體基因組編碼，表明了線粒體對細胞核基因座的嚴重依賴(Naviaux，1997)。?一旦發(fā)生受精，由于卵細胞中線粒體的克隆擴增，給定個體中所有線粒體DNA(mtDNA)基因組是相同的。mtDNA的關鍵作用是產(chǎn)生驅動細胞代謝的細胞燃料——三磷酸腺苷(ATP)。重要地，除了由線粒體基因組提供的13種多肽以外，該線粒體基因組依賴70種細胞核編碼的蛋白質來完成該生命功能所必需的氧化和還原反應(Leonard和Shapira，1997)。不同的組織和器官對氧化磷酸化的依賴程度不同。與氧化磷酸化(OXPHOS)缺陷相關的疾病看來與mtDNA突變有緊密的聯(lián)系(Byrne，1992)。由于mtDNA突變的嚴重性提高而導致OXPHOS降低而超出了器官特異性能量閾值，這引起多種臨床表型。而且，線粒體基因組中的突變與多種慢性退行性疾病有關(Gattermann等1995)。眾所周知，衰老和特定類型的疾病可以使mtDNA發(fā)生改變或突變，使細胞的能量產(chǎn)生能力受損。這常常導致缺陷線粒體的過表達和/或細胞通過增加糖酵解來補充ATP的缺乏(Carew和Huang，2002)；因此，當以連續(xù)的間隔進行監(jiān)測時，線粒體基因組中的改變或突變可以用作疾病發(fā)生和/或疾病發(fā)展的標記。?最近，F(xiàn)liss等(2000)在來自肺及膀胱的癌癥的原發(fā)性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了天然情況下主要為同質的mtDNA發(fā)生高頻率突變，表明突變mtDNA在惡性腫瘤細胞中占多數(shù)。點突變和缺失看來是氧自由基對線粒體膜和基因組造成損傷的非程序性但卻不可避免的副作用(Miquel等1992)。這個理論看來言之有理，不僅因為線粒體基因組缺乏保護性組蛋白，還因為在產(chǎn)生氧的線粒體內膜附近發(fā)現(xiàn)了對氧化損傷的敏感性。而且，由于mtDNA具有緊湊的基因組并缺少內含子，因此有害事件很可能影響編碼序列，引起生物化學功能異常。這種功能異常將進一步增加細胞的氧化應激，這將引起核及mtDNA的損傷，從而提高細胞進入癌化過程的可能性(Penta?等，2001)。在這方面，研究表明隨著年齡的增長，mtDNA的損傷增加(Cortopassi&Wang1995)，呼吸功能隨之衰退(Miquel等1992)，最終導致細胞死亡。?mtDNA作為診斷工具?mtDNA序列動力學情況是重要的診斷工具。mtDNA中的突變常常是正在發(fā)展中疾病的先期指示，常常與細胞核突變有關，并作為與疾病特異性相關的生物標志物，所述疾病例如但不僅限于：吸煙和接觸二手煙引起的組織損傷和癌癥(Lee等，1998；Wei，1998)；基于從約20歲開始并在之后逐漸提高的線粒體基因組突變累積的壽命((von?Wurmb，1998)；由突變或接觸致癌物、誘變劑、紫外線輻射照射而引起的轉移性疾病(Birch-Machm，2000)；骨關節(jié)炎；心血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森病(Shoffner等，1993；Sherratt等，1997；Zhang等，1998)；與年齡相關的聽力喪失(Seidman等，1997)；視神經(jīng)退化和心率失常(Brown等，1997；Wallace等，1988)；慢性進行性external?exophthalmoplegia?(Taniike等，1992)；動脈硬化(Bogliolo等，1999)；乳頭狀甲狀腺癌和甲狀腺瘤(Yeh等，2000)等等(例如Naviaux，1997；Chinnery?and?Turnbull，1999)。?線粒體基因組特定位點的突變可與某些疾病相關。例如，在4216、4217和4917位的突變與Leber′s遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)(Mitochondrial?Research?Society；Huoponen(2001)；MitoMap)相關。在5/5個泛醇細胞色素C還原酶(復合體III)缺陷的患者中發(fā)現(xiàn)了15452位的突變(Valnot等1999)。然而，還未這些位點的突變與前列腺癌有關。?具體地，這些改變包括點突變(轉換、顛換)、缺失(一個堿基至數(shù)千個堿基)、倒位、復制(一個堿基至數(shù)千個堿基)、重組以及插入(一個堿基至數(shù)千個堿基)。另外，特定的堿基對改變、缺失或其組合與前列腺癌、皮膚癌和肺癌的早期發(fā)作以及衰老(例如Polyak等，1998)、提前衰老、接觸致癌物(Lee等，1998)等有關。?因為mtDNA僅通過卵細胞向后代傳遞，所以急需通過這種遺傳手段了解線粒體序列。mtDNA的序列在母系譜系之間有廣泛的變異(Ward等，1991)，因此，必須與這種變異相比清楚地了解與疾病相關的突變。例如，若干個體的序列中與特定癌癥相關的特定T向C的轉換實際上可能是在給定的特定地理區(qū)域或與種族相關的母系譜系中廣泛的天然變異。例如，北美本地人表現(xiàn)出異常高的成年糖尿病發(fā)病頻率。另外，所有的北美本地人在遺傳上可表征為5個基本的母系譜系，命名為A、B、C、D和X(Schurr等，1990；Stone和Stoneking，1993；Smith等，1999)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
用于檢測跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失的方法，其中所述缺失與皮膚癌和/或UV照射有關，所述方法包括檢測生物樣品的mtDNA中所述缺失的存在情況。

【技術特征摘要】
2005.04.18 US 60/672,016;2005.09.29 US 60/721,522;1.用于檢測跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸
的缺失的方法，其中所述缺失與皮膚癌和/或UV照射有關，所述方法包
括檢測生物樣品的mtDNA中所述缺失的存在情況。
2.權利要求1的方法，其中所述生物樣品是來自受試者的皮膚樣
品。
3.權利要求1的方法，其中所述生物樣品是組織培養(yǎng)樣品。
4.權利要求3的方法，其還包括在檢測所述缺失的存在情況的步驟
前將所述組織培養(yǎng)樣品暴露于至少一個亞致死劑量的紫外線輻射
(UVR)。
5.權利要求4的方法，其中將所述生物樣品暴露于一系列重復性亞
致死劑量的UVR。
6.權利要求5的方法，其中所述系列包括將所述生物樣品暴露于日
劑量的UVR。
7.權利要求4的方法，其中所述UVR來自模擬太陽的UVR源。
8.權利要求4的方法，其中所述UVR包含UVA、UVB或UVA/UVB。
9.權利要求1的方法，其中所述方法用于檢測皮膚癌。
10.用于測定累積性UV照射的方法，所述方法包括在生物樣品中
檢測跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失的存
在情況。
11.用于監(jiān)測臨床UV光療方案的長期安全性的方法，所述方法包
括在生物樣品中檢測跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核
苷酸的缺失的存在情況。
12.用于監(jiān)測日光照射或相關的非黑色素瘤皮膚癌(NMSC)的方
法，所述方法包括在經(jīng)一段時間間隔獲得的生物樣品中檢測跨越人
mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失的存在情況。
13.權利要求1至12中任一項的方法，其中所述缺失為約3895bp。
14.權利要求1至12中任一項的方法，其中所述缺失包含從D-環(huán)
中的mtTF1結合位點左右至tRNA甲硫氨酸的mtDNA段。
15.權利要求1的方法，其中所述缺失基本上包含12s?rRNA基因、
16s?rRNA基因、ND1基因以及用于H和L鏈轉錄的啟動子。
16.權利要求1至12中任一項的方法，其中檢測mtDNA中所述缺
失的存在情況的步驟包括擴增所述mtDNA。
17.權利要求1至12中任一項的方法，其中檢測mtDNA中所述缺
失的存在情況的步驟包括選自以下的PCR分析：缺失特異性PCR分析，
放射性PCR分析，定量PCR，實時PCR(RT-PCR)分析或使用重組、
熱穩(wěn)定Taq?DNA聚合酶的RT-PCR。
18.權利要求1至12中任一項的方法，其中檢測mtDNA中所述缺
失的存在情況的步驟包括使用跨過mtDNA接合處的引物的PCR分析，
所述接合處由跨越約547至4443位核苷酸的所述缺失形成。
19.權利要求17的方法，其中使用跨過mtDNA接合處的PCR引
物進行所述PCR分析，所述接合處由跨越約547至4443位核苷酸的所
述缺失形成。
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【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：瑞安·帕爾，羅伯特·塞耶，加百利·道庫博，珍妮弗·克里德，克里·魯賓遜，安德烈婭·馬格拉，布賴恩·賴古伊，安德烈·哈博特爾，馬克·比爾克馬金，
申請(專利權)人：米托米克斯公司，
類型：發(fā)明
國別省市：加拿大;CA