一種制備人纖維蛋白原制劑的方法及其制備的制劑技術

本發(fā)明專利技術公開了一種制備人纖維蛋白原制劑的方法，該方法以健康人血漿為原料，經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法分離純化，其中采用溫和的壓濾法替代了離心法，并用低溫乙醇溶液對沉淀進行頂洗；增加了多級深層過濾；改進了凍干工藝，使凍干周期由4～8天縮短到2～3天；并將S/D法、UVC照射法和干熱法結合對病毒進行滅活處理，保證了對脂包膜、非脂包膜病毒尤其是耐熱的細小病毒的去除效果。本發(fā)明專利技術還公開了由上述方法制備的人纖維蛋白原制劑。本發(fā)明專利技術生產(chǎn)出的人纖維蛋白原制劑質量更穩(wěn)定，雜質含量更低，病毒安全性更高，能最大限度的減少輸注該制劑可能給患者帶來的安全風險，降低了臨床應用時副反應的發(fā)生，使用藥更安全。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及血液制品領域，特別是涉及一種制備人纖維蛋白原制劑的方法及其制備的制劑。
技術介紹
纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)g)，即凝血因子Ⅰ(FⅠ)，是凝血系統(tǒng)中的“中心”蛋白質之一，相對分子量340kDa，具有2964(6)個氨基酸殘基，分子長度約為45nm，寬度最大直徑為4.8nm，半衰期為96～144小時，等電點為5.1～5.5，沉降系數(shù)為7.7～7.9。Fg主要由肝臟合成，是一種糖蛋白，含碳水化合物3％～5％，由兩個相同部分組成，每個部分含有3條肽鏈，即Aα、Bβ和γ鏈，分別由610、461和410個氨基酸殘基構成。每部分由12個二硫鍵相連，兩個部分之間通過兩條γ鏈的半胱氨酸8、9及Aα鏈的半胱氨酸28所形成的3個二硫鍵在氨基端相連。大部分存在于人體血漿中，約15％存在于血管外，正常人血漿中Fg的含量為2.0～4.0g/L，是血漿粘滯性的主要決定因素，止血需要量約為正常的25％～50％，血漿水平低于1～1.5g/L可能引起凝血障礙。纖維蛋白原在凝血酶的作用下裂解釋放纖維蛋白肽A和B，形成纖維蛋白，與血小板一起形成穩(wěn)固的纖維蛋白血栓，完成止血機制。Fg是由健康人血漿經(jīng)分離、提純并經(jīng)病毒滅活處理制成的，主要應用于先天性、獲得性纖維蛋白原減少癥、嚴重肝臟損傷、肝硬化、DIC以及手術或者產(chǎn)后大出血等的治療，是臨床上用于大出血止血的必備急救藥品之一。其制備方法直接影響產(chǎn)品的質量和安全性。早在20世紀40年代，采用Cohn低溫乙醇法分離出來的Fg制品就已應用于臨床；但當時Fg制品的生產(chǎn)工藝中尚不含對制品的病毒滅活處理，這導致患者在輸注后引起病毒性肝炎的危險性很大，一些歐美國家相繼停止了Fg制品的制備與應用。美國FDA于1977年12月撤銷了Fg制品的生產(chǎn)許可證，并于1978年7月禁止其使用。20世紀8O年代以后，F(xiàn)g制品病毒滅活方法的研究取得成功，使該制品又重新開始生產(chǎn)。2002年國家食品藥品督管理局(SFDA)發(fā)布《血液制品去除/滅活病毒技術方法及驗證指導》，要求在凝血因子類制品的生產(chǎn)過程中，應有特定的能去除/滅活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，以減少產(chǎn)品攜帶病毒的風險，確保制品的安全。目前，國內上市的Fg制品均為S/D法聯(lián)合干熱法進行病毒滅活，但S/D法僅能滅活脂包膜病毒如危害性較大的HBV、HCV和HIV等，對人細小病毒(B19)、HAV等非脂包膜病毒無殺滅作用。干熱法即凍干制劑經(jīng)過加熱處理殺滅病毒的方法，目前采用較多的是100℃30min干熱處理，該法已被證明能有效滅活HBV、HCV、HIV等脂包膜病毒及EMCV、HAV等非脂包膜病毒，其病毒滅活效果已為實驗室驗證和臨床應用所肯定，為控制凝血因子類制品病毒感染發(fā)揮了重要作用，但早在1997年就有過8名血友病患者采用經(jīng)100℃30min干熱法滅活的凝血因子制品治療后感染B19的報道；2005年Prikhod’ko等的研究顯示，殘留水分為0.5％～0.7％的人纖維蛋白原，經(jīng)100℃3h干熱法滅活處理后，B19病毒僅降低(2～3)log。可見干熱法對B19等耐熱性非脂包膜病毒有一定滅活效果，但無法完全阻斷B19的傳染，存在一定風險。針對B19這類耐熱性較強的非脂包膜病毒，還應與其他滅活方法結合使用，以確保制品的安全性。由此可見，上述現(xiàn)有的制備人纖維蛋白原制劑的方法顯然仍存在有不足，而亟待進一步改進。如何能創(chuàng)設一種制備的人纖維蛋白原制劑純度高、穩(wěn)定性高、病毒滅活效果好的新的方法及其制備的制劑，為當前重要研發(fā)課題之一。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種制備人纖維蛋白原制劑的方法及其制備的制劑，使其制得的人纖維蛋白原制劑純度高、穩(wěn)定性高、病毒滅活效果好，從而克服現(xiàn)有的制備人纖維蛋白原制劑方法的不足。為解決上述技術問題，本專利技術提供一種制備人纖維蛋白原制劑的方法，制備方法步驟如下：(1)分離組分I：將病毒檢測合格并且符合國家檢疫期規(guī)定的原料血漿,在溫度0℃±2.5℃、乙醇濃度8～10％、pH7.0±0.20條件下，攪拌1～3小時，然后通過壓濾法分離出組分I；(2)洗滌/溶解組分I：將組分I沉淀粉碎后，加入體積升數(shù)為組分I千克數(shù)20±5倍的枸櫞酸鈉-甘氨酸緩沖液中，在溫度0℃±2.5℃條件下攪拌洗滌30～60分鐘，通過壓濾法分離出洗滌后的沉淀A，將該沉淀A粉碎，加入到體積升數(shù)為沉淀A千克數(shù)3～5倍的三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩沖液中，在溫度20℃～30℃的條件下攪拌溶解1～3小時，用三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩沖液稀釋至體積升數(shù)為沉淀A千克數(shù)的10～12倍，澄清過濾，取濾液備用；(3)S/D滅活處理：計量步驟(2)得到的濾液體積后，在攪拌過程中，加入1/10濾液體積的S/D溶液，所述S/D溶液含110g/L聚山梨酯80和33g/L磷酸三丁酯，溫度20℃～30℃，調制溶液pH至7.00±0.20，并在水浴24℃～26℃的條件下緩慢攪拌滅活4～8小時；(4)乙醇沉淀：將步驟(3)得到的溶液澄清過濾后，降溫至0℃～2℃，在攪拌過程中，加入預冷至-5℃以下的50％乙醇溶液，使溶液中乙醇終含量為8％～10％，并調整溫度至-2℃～2℃，pH至7.00±0.20，攪拌反應0.5～1.5小時，通過壓濾法分離出沉淀B，將沉淀B加入到體積升數(shù)為沉淀B千克數(shù)13～15倍的三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩沖液中，保持溫度30℃～37℃，攪拌溶解0.5～1.5小時，澄清過濾，重復本步驟上述操作一次，通過壓濾法分離出沉淀C；(5)原液制備：將沉淀C粉碎后，加入到體積升數(shù)為沉淀C千克數(shù)4～8倍的鹽酸精氨酸-枸櫞酸鈉緩沖液中，在30℃～37℃的條件下攪拌溶解0.5～1.5小時，澄清過濾后，用鹽酸精氨酸-枸櫞酸鈉緩沖液調整溶液中蛋白質含量至2.2％～3.0％，調整pH值為6.5～7.5，得原液；(6)UVC照射處理：將原液放置于UVC滅活儀中，經(jīng)強度為90～140J/m2UVC照射處理；(7)除菌過濾及分裝。作為本專利技術的進一步改進，所述方法還包括：將步驟(7)得到的分裝樣品凍干，所述凍干過程中包括預冷、退火操作步驟。進一步改進，所述凍干步驟為：5℃預冷1h、-40℃凍結3h、-10℃～-5℃退火2h、-40℃凍結3h、-5℃～0℃升華20h、20℃～25℃升溫干燥10h～20h，真空封口，且凍干過程中制品溫度不超過30℃。進一步改進，所述方法還包括：將所得的凍干制劑經(jīng)沸水浴本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種制備人纖維蛋白原制劑的方法，其特征在于，所述制備方法步驟如下：(1)分離組分I：將病毒檢測合格并且符合國家檢疫期規(guī)定的原料血漿,在溫度0℃±2.5℃、乙醇濃度8～10％、pH7.0±0.20條件下，攪拌1～3小時，然后通過壓濾法分離出組分I；(2)洗滌/溶解組分I：將組分I沉淀粉碎后，加入體積升數(shù)為組分I千克數(shù)20±5倍的枸櫞酸鈉?甘氨酸緩沖液中，在溫度0℃±2.5℃條件下攪拌洗滌30～60分鐘，通過壓濾法分離出洗滌后的沉淀A，將該沉淀A粉碎，加入到體積升數(shù)為沉淀A千克數(shù)3～5倍的三羥甲基氨基甲烷?枸櫞酸鈉緩沖液中，在溫度20℃～30℃的條件下攪拌溶解1～3小時，用三羥甲基氨基甲烷?枸櫞酸鈉緩沖液稀釋至體積升數(shù)為沉淀A千克數(shù)的10～12倍，澄清過濾，取濾液備用；(3)S/D滅活處理：計量步驟(2)得到的濾液體積后，在攪拌過程中，加入1/10濾液體積的S/D溶液，所述S/D溶液含110g/L聚山梨酯80和33g/L磷酸三丁酯，溫度20℃～30℃，調制溶液pH至7.00±0.20，并在水浴24℃～26℃的條件下緩慢攪拌滅活4～8小時；(4)乙醇沉淀：將步驟(3)得到的溶液澄清過濾后，降溫至0℃～2℃，在攪拌過程中，加入預冷至?5℃以下的50％乙醇溶液，使溶液中乙醇終含量為8％～10％，并調整溫度至?2℃～2℃，pH至7.00±0.20，攪拌反應0.5～1.5小時，通過壓濾法分離出沉淀B，將沉淀B加入到體積升數(shù)為沉淀B千克數(shù)13～15倍的三羥甲基氨基甲烷?枸櫞酸鈉緩沖液中，保持溫度30℃～37℃，攪拌溶解0.5～1.5小時，澄清過濾，重復本步驟上述操作一次，通過壓濾法分離出沉淀C；(5)原液制備：將沉淀C粉碎后，加入到體積升數(shù)為沉淀C千克數(shù)4～8倍的鹽酸精氨酸?枸櫞酸鈉緩沖液中，在30℃～37℃的條件下攪拌溶解0.5～1.5小時，澄清過濾后，用鹽酸精氨酸?枸櫞酸鈉緩沖液調整溶液中蛋白質含量至2.2％～3.0％，調整pH值為6.5～7.5，得原液；(6)UVC照射處理：將原液放置于UVC滅活儀中，經(jīng)強度為90～140J/m2UVC照射處理；(7)除菌過濾及分裝。...

【技術特征摘要】
1.一種制備人纖維蛋白原制劑的方法，其特征在于，所述制備方法步
驟如下：
(1)分離組分I：將病毒檢測合格并且符合國家檢疫期規(guī)定的原料血
漿,在溫度0℃±2.5℃、乙醇濃度8～10％、pH7.0±0.20條件下，攪拌1～
3小時，然后通過壓濾法分離出組分I；
(2)洗滌/溶解組分I：將組分I沉淀粉碎后，加入體積升數(shù)為組分I
千克數(shù)20±5倍的枸櫞酸鈉-甘氨酸緩沖液中，在溫度0℃±2.5℃條件下攪
拌洗滌30～60分鐘，通過壓濾法分離出洗滌后的沉淀A，將該沉淀A粉碎，
加入到體積升數(shù)為沉淀A千克數(shù)3～5倍的三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩
沖液中，在溫度20℃～30℃的條件下攪拌溶解1～3小時，用三羥甲基氨基
甲烷-枸櫞酸鈉緩沖液稀釋至體積升數(shù)為沉淀A千克數(shù)的10～12倍，澄清
過濾，取濾液備用；
(3)S/D滅活處理：計量步驟(2)得到的濾液體積后，在攪拌過程中，
加入1/10濾液體積的S/D溶液，所述S/D溶液含110g/L聚山梨酯80和33g/L
磷酸三丁酯，溫度20℃～30℃，調制溶液pH至7.00±0.20，并在水浴24
℃～26℃的條件下緩慢攪拌滅活4～8小時；
(4)乙醇沉淀：將步驟(3)得到的溶液澄清過濾后，降溫至0℃～2
℃，在攪拌過程中，加入預冷至-5℃以下的50％乙醇溶液，使溶液中乙醇終
含量為8％～10％，并調整溫度至-2℃～2℃，pH至7.00±0.20，攪拌反應0.5
～1.5小時，通過壓濾法分離出沉淀B，將沉淀B加入到體積升數(shù)為沉淀B
千克數(shù)13～15倍的三羥甲基氨基甲烷-枸櫞酸鈉緩沖液中，保持溫度30℃～
37℃，攪拌溶解0.5～1.5小時，澄清過濾，重復本步驟上述操作一次，通
過壓濾法分離出沉淀C；
(5)原液制備：將沉淀C粉碎后，加入到體積升數(shù)為沉淀C千克數(shù)4～
8倍的鹽酸精氨酸-枸櫞酸鈉緩沖液中，在30℃～37℃的條件下攪拌溶解0.5
～1.5小時，澄清過濾后，用鹽酸精氨酸-枸...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：馬小偉，梁雪爽，張學成，謝來峰，李冠軍，王學位，
申請(專利權)人：華蘭生物工程股份有限公司，華蘭生物疫苗有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：河南;41