一種血小板及含有血小板的制劑的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種血小板及含有血小板的制劑的制備方法，屬于血液成分分離領(lǐng)域。該制備方法包括：將抗凝全血樣品進行第一次離心得到上層液；再對上層液進行過濾處理以去除上層液中的白細胞，得到濾液；隨后對濾液進行第二次離心，保留沉淀。該方法能夠有效的去除血小板中混有的白細胞，且能夠有效避免血小板的損失，從而提高所制得的血小板的純度和回收率。通過這種方法所得到的血小板的純度高達95％以上，且血小板的回收率高達80％以上。此外，這種方法的工藝步驟簡單，所使用的試劑及設(shè)備均容易得到且價格低廉，因此其制備高純度的血小板的成本低、周期短。

Preparation method of platelet and preparation containing platelet

The invention provides a preparation method of platelet and preparation containing platelet, belonging to the field of blood component separation. The preparation method comprises the following steps: anticoagulated whole blood sample for the first time to get the upper centrifugal liquid; the upper liquid was filtered to remove the upper liquid of white blood cells, then get filtrate; second times of centrifugal filtrate, retain precipitation. The method can effectively remove the mixed white blood cells in the platelets, and can effectively avoid the loss of platelets, thereby improving the purity and the recovery rate of the prepared platelets. By this method, the purity of the obtained platelet is higher than 95%, and the recovery rate of the platelet is more than 80%. In addition, the process is simple, the reagents and equipment used are easy to obtain and the price is low, so the preparation of high-purity platelets has low cost and short cycle.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種血小板及含有血小板的制劑的制備方法
本專利技術(shù)涉及血液成分分離領(lǐng)域，具體而言，涉及一種血小板及含有血小板的制劑的制備方法。
技術(shù)介紹
血小板，是哺乳動物中的有形成分之一，是從骨髓成熟的巨核細胞胞質(zhì)裂解脫落下來的具有生物活性的小塊胞質(zhì)。血小板的體積小，無細胞核，呈雙面微凹的圓盤狀，直徑為2-3微米。血小板具有特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生化組成，其在止血、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理過程中有重要作用。現(xiàn)有的血小板制備方法主要有：洗滌法、梯度密度離心法、凝膠過濾法、免疫磁珠分選技術(shù)、以及流式細胞術(shù)。這些方法都各有優(yōu)劣，比如洗滌法和梯度密度離心法，適用于少量血液中血小板的分離純化，但血小板的純度和回收率都會相對偏低；凝膠過濾法也是適用于少量血液中血小板的分離純化，雖然其能提高血小板的純度，但其操作復(fù)雜、分離難度大；同時，免疫磁珠分選技術(shù)，雖然該方法得到的血小板的回收率和純度均較高，但該方法所用的磁珠以及抗體的價格高昂，導(dǎo)致分離純化的成本高；而采用流式細胞儀，一次上機全血至少是400mL，不適用少量全血中血小板的分離，且費用昂貴、整個分離流程所需時間較長。因此，目前急需一種成本低廉且能夠大幅提高血小板的純度及回收率的血小板的制備方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的第一目的在于提供一種血小板的制備方法，這種制備方法能夠有效的去除血小板中混有的白細胞，且能夠有效避免血小板的損失，從而提高所制得的血小板的純度和回收率。本專利技術(shù)的第二目的在于提供一種含有血小板的制劑的制備方法，由這種制備方法制得的制劑中，血小板的純度高，且其中不含白細胞，使用安全性高。為了實現(xiàn)本專利技術(shù)的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種血小板的制備方法，其包括：將抗凝全血樣品進行第一次離心得到上層液；再對上層液進行過濾處理以去除上層液中的白細胞，得到濾液；隨后對濾液進行第二次離心，保留沉淀。一種含有血小板的制劑的制備方法，該血小板是通過上述方法制備得到。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果為：本專利技術(shù)提供的血小板的制備方法，適用于較少量的全血中(低至1ml)的血小板的分離，通過這種方法能夠有效的去除血小板中混有的白細胞，且能夠有效避免血小板的損失，從而提高所制得的血小板的純度和回收率，在本專利技術(shù)中，通過這種方法所得到的血小板的純度高達95％以上，且血小板的回收率高達80％以上。此外，這種方法的工藝步驟簡單，所使用的試劑及設(shè)備均容易得到且價格低廉，因此其制備高純度的血小板的成本低、周期短。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本專利技術(shù)的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本專利技術(shù)，而不應(yīng)視為限制本專利技術(shù)的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。目前，從全血中分離血小板的技術(shù)主要有：洗滌法、梯度密度離心法、凝膠過濾法、流式細胞儀、以及免疫磁珠分選技術(shù)。但是對于如何在較低成本下從較少量的全血中分離得到高純度(至少大于90％)的血小板，上述技術(shù)均無法實現(xiàn)。這主要是因為：流式細胞儀對上機血量有要求(至少大于400mL)，因此不適用于少量全血的分離；免疫磁珠分選技術(shù)雖然能夠得到高純度及高回收率的血小板，然而磁珠及抗體的價格高昂，導(dǎo)致分離純化的成本偏高，不實用；而洗滌法、梯度密度離心法、凝膠過濾，這3種方法是根據(jù)血小板的物理屬性進行分離，不能有效去除白細胞，且血小板損失量較大，使得最后所得到的血小板的純度及回收率均偏低。鑒于此，本實施方式提供一種血小板的制備方法，其包括：S1:將抗凝全血樣品進行第一次離心后，得到上層液?？鼓獦悠肥峭ㄟ^將新鮮采集的全血樣品與抗凝劑混合制得。例如，進一步的，抗凝全血樣品可以是通過用含抗凝劑的采血管采集靜脈血得到，比如用枸櫞酸鈉抗凝管采集靜脈血。為了使血小板的分離純化效果更佳，在本專利技術(shù)中，選用較少量的抗凝全血樣品，比如選用體積為10～15mL的抗凝全血樣品。通常在采血后，在室溫下運輸采集的全血樣品，盡量避免劇烈震蕩，并盡可能在較短的時間內(nèi)進行血小板的分離，以得到較高的回收率。抗凝全血樣品在第一次離心后，血液分為三層，下層呈暗紅色，主要為質(zhì)量較大的紅細胞，其占血液總量的50％～80％；中層呈白色，極薄，為白細胞；上層呈淡黃色，為富含血小板的血漿，分離上層后，即得到上層液。在本專利技術(shù)較佳的實施例中，第一次離心是將抗凝全血樣品在100～200g的相對離心力下離心10～20min；優(yōu)選為，將抗凝全血樣品在150g的相對離心力下離心15min。這一條件能夠滿足在最大程度的沉降紅細胞和白細胞的同時，又能避免血小板的沉降，從而避免血小板的損失。S2:再對上層液進行過濾處理以去除上層液中的白細胞。第一步離心后，通常會有部分白細胞懸浮在上層，為了進一步純化血小板，在本專利技術(shù)中，采用過濾的方式將上層液中的白細胞去除，以得到高純度的血小板。較為優(yōu)選的，對上層液進行過濾處理時，所使用的過濾膜具有能夠截留白細胞、且能夠使血小板和血漿透過的微孔。這種過濾膜可商用購買。進一步的，在本專利技術(shù)較佳的實施例中，采用去白細胞過濾器對上層液進行過濾處理。由于去白細胞在臨床上具有非常重要的意義，因此去白細胞過濾器已作為常規(guī)產(chǎn)品廣泛應(yīng)用在去除白細胞輸血技術(shù)。這種去白細胞過濾器對白細胞的截流率高達90％以上，因此能夠有效的去除上層液中混有的白細胞，從而提高血小板的純度。更進一步優(yōu)選的，為了避免血小板的損失，在對上層液進行過濾處理后，還包括用緩沖液洗滌去白細胞過濾器的步驟。該緩沖液為pH值例如可以為7.2～7.6的緩沖液。該緩沖液例如可以為臺式緩沖液，其包括：134mM的NaCl、12mM的NaHCO3、2.9mM的KCl、0.34mM的Na2HPO4、1mM的MgCL2以及10mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸。當(dāng)然也可以采用其他能夠滿足需求的緩沖液。在對上層液進行過濾處理時，可以采用加壓的方式進行過濾，也可以直接進行常壓過濾，即在重力的作用下過濾。采用加壓的方式進行過濾時，由于上層液的流速較快，去白細胞過濾器對白細胞的截留量略低。此外，還應(yīng)避免壓力過大，導(dǎo)致細胞破裂、溶解的情況發(fā)生。優(yōu)選的，在重力作用下，對上層液進行過濾處理。在重力作用下過濾，既能防止細胞破裂引起的污染，又能減緩過濾時上層液的流速，使得盡可能多的白細胞被截留。S3:隨后對所得濾液進行第二次離心。在對上述濾液進行第二次離心后，血小板與血漿(及洗滌的緩沖液)分離，呈白色固體狀沉淀在底部，且肉眼可見，將上層的上清液分離后，得到血小板沉淀，即為純化后的血小板。在本專利技術(shù)較佳的實施例中，第二次離心是將濾液在1500～2500g的相對離心力下離心5～15min，更為優(yōu)選的，將濾液在2000g的相對離心力下離心10min。這一條件是專利技術(shù)人在多年的理論研究和實踐探索中得到的優(yōu)選范圍，采用這一條件進行第二次離心，能夠在得到高純度的血小板的同時，又能較大限度的避免血小板的損失。本專利技術(shù)提供的血小板的制備方法，適用于較少量的全血中的血小板的分離，通過這種方法能夠有效的去除血小板中混有的白細胞，且能夠有效避免血小板的意外損失，從而提高所制得的血小板的純度和回收率。此外，這種方法的工藝步驟簡單，所使用的試劑及設(shè)備均容易得到且價格低廉本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種血小板的制備方法，其特征在于，其包括：將抗凝全血樣品進行第一次離心得到上層液；再對所述上層液進行過濾處理以去除所述上層液中的白細胞，得到濾液；隨后對所述濾液進行第二次離心，保留沉淀。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種血小板的制備方法，其特征在于，其包括：將抗凝全血樣品進行第一次離心得到上層液；再對所述上層液進行過濾處理以去除所述上層液中的白細胞，得到濾液；隨后對所述濾液進行第二次離心，保留沉淀。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血小板的制備方法，其特征在于，過濾處理所述上層液的方法包括：采用過濾膜對所述上層液進行過濾，所述過濾膜具有能夠截留白細胞、且能夠使血小板透過的微孔。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血小板的制備方法，其特征在于，過濾處理所述上層液的方法包括：采用去白細胞過濾器對所述上層液進行過濾。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血小板的制備方法，其特征在于，過濾處理所述上層液的方法還包括：在采用去白細胞過濾器對所述上層液進行過濾后，用緩沖液洗滌所述去白細胞過濾器。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血小板的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：宋馳，
申請(專利權(quán))人：武漢貝納科技服務(wù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：湖北,42