一種溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針及其制備方法和用途技術

本發明專利技術公開了一種溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針及其制備方法和用途，其中黏度熒光探針以萘二甲酰亞胺作為母體，結構如下：

Lysosome targeted two-photon photon fluorescent probe, preparation method and application thereof

The invention discloses a lysosome targeted two-photon viscosity fluorescent probe, a preparation method and an application thereof, wherein, the viscosity fluorescence probe takes naphthalene two imide as the mother body and is structured as follows:

【技術實現步驟摘要】
一種溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針及其制備方法和用途一、
本專利技術涉及一種雙光子熒光探針，具體地說是一種溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針及其制備方法和用途。二、
技術介紹
黏度是細胞中液質流動過程中的重要影響因素，同時，它作為生物體系微環境中的一個重要的性質，影響著物質的傳輸以及生物分子的相互作用。不正常的黏度變化與生物體系中多種疾病或生理過程有緊密的聯系。因此，如何檢測細胞中的黏度對生物體系有很重要的意義，這方面的研究也已經引起了很多科學家們的興趣。熒光探針作為一種檢測工具有很多的優點，比如：靈敏度高，操作方便，廉價易得等等。檢測對象與熒光探針作用能夠引起熒光信號的響應變化，從而檢測出檢測對象的變化。萘二甲酰亞胺作為一種典型的熒光團，不僅具有優良的熒光光譜性質，而且水溶性好，并且細胞毒性低。以萘二甲酰亞胺作為熒光團的單光子熒光探針已經被很多文獻所報道，但是作為雙光子熒光探針的文獻報道還很少。檢測細胞溶酶體黏度的雙光子熒光探針的報道就更少了。目前，大部分檢測細胞黏度的熒光探針仍為單光子的熒光探針，然而單光子熒光探針具有不少的缺點，如：自熒光干擾很大，激發波長小導致對細胞的光毒性大，容易發生熒光自淬滅等等。雙光子熒光探針具有很多單光子熒光探針所不具有的優點，如：細胞光毒性小，不會引起熒光自淬滅，時間空間分辨率高，組織滲透深度大，因而雙光子熒光探針已經作為科學家們研究的一個重要課題。三、
技術實現思路
本專利技術旨在提供一種溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針及其制備方法和用途，所要解決的技術問題是通過分子設計遴選出一種合適的熒光探針結構，以實現雙光子成像定性檢測細胞溶酶體黏度，細胞毒性實驗表明本專利技術對細胞幾乎沒有毒副作用。本專利技術溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針(Lyso-NP)，簡稱為熒光探針，是以萘二甲酰亞胺為母體，其結構式如下：本專利技術溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針的制備方法，包括如下步驟：將化合物1(3.89g)、1，4-二甲胺基苯乙炔(1.74g)、三苯基膦二氯化鈀(0.1g)、碘化亞銅(0.5g)加入到反應器中，然后加入三乙胺(3.66g)和N-甲基吡咯烷酮(20ml)，升溫至80℃反應12h；反應結束后過濾，濾液蒸發干燥得粗產物，再用柱層析色譜柱分離(以乙酸乙酯/石油醚＝1/2作為洗脫液，v/v)，得到目標產物3.64g(8.03mmol)，收率80％。所述化合物1的結構式為：本專利技術溶酶體靶向的雙光子熒光黏度探針Lyso-NP的合成過程如下：本專利技術溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針在定性檢測細胞中黏度時作為檢測試劑應用。將本專利技術熒光探針溶于DMSO中制得1mM的母液，取100μL的該母液于10mL容量瓶中，再用待測溶液定容，配制成10μM。熒光探針單光子和雙光子的激發波長分別為460nm和920nm，檢測500-750nm波長范圍內的熒光光譜變化。本專利技術熒光探針檢測黏度的機理是熒光探針分子中的萘二甲酰亞胺與1，4-二甲胺基苯乙炔的C-C單鍵的旋轉，黏度小的體系中，C-C單鍵的旋轉所消耗的能量多，分子受激發到激發態后，能量耗散的方式主要為C-C單鍵旋轉；黏度大的體系中，C-C單鍵的旋轉受到抑制，分子受激發到激發態后，能量耗散的方式主要為熒光發射，在530nm處熒光發射峰隨著體系黏度增大逐漸增強。這樣設計的目的實現了對黏度的檢測。本專利技術熒光探針在低粘度體系中熒光量子產率較低，在高黏度體系中熒光量子產率升高了8倍左右。因此，本專利技術熒光探針能更好地應用于生物檢測中。本專利技術熒光探針能夠對生物細胞體系中的溶酶體黏度進行轉移性的識別，監測分析以及跟蹤。本專利技術熒光探針結構簡單，合成方便。本專利技術熒光探針是以熒光強弱來檢測黏度的高低。在紫外燈下，肉眼就可以看出其熒光變化，熒光顏色從無變為綠色熒光，操作簡便，反應靈敏。本專利技術熒光探針選擇性高，靈敏度高。四、附圖說明圖1是本專利技術熒光探針Lyso-NP(10μM)在純甘油和純水中的紫外吸收光譜。圖2是本專利技術熒光探針Lyso-NP(10μM)在不同黏度體系中的熒光濃度光譜圖，每條線都在靜置30min后進行的測試。圖3是本專利技術熒光探針Lyso-NP(0.5mM)在甘油中在不同的波長激發下雙光子吸收截面值。圖4是本專利技術熒光探針Lyso-NP在MCF-7細胞培養24h后的細胞存活率。從圖4中我們可以看出，濃度為20μM時，細胞存活率還有90％左右，說明本專利技術熒光探針對細胞無毒性作用，因此可以用來做細胞中黏度檢測。圖5是本專利技術熒光探針Lyso-NP在MCF-7細胞中的溶酶體定位成像照片。探針Lyso-NP(10μM)加入到MCF-7細胞中培養30分鐘，然后再向其中加入溶酶體染料LysoTrackerRedFM(0.5μM)，繼續培養10分鐘。其中圖(a)綠色通道(510-560nm)，λex＝960nm；(b)紅色通道(580-620nm)，λex＝599nm；(c)是(a)和(b)通道的疊加圖；(d)MCF-7細胞中選取的截面熒光強度分析，綠線表示探針Lyso-NP的熒光強度，紅線表示溶酶體染料LysoTrackerRedFM的熒光強度。圖6是本專利技術熒光探針的雙光子共聚焦成像照片，其中圖a是熒光探針(10μM)在MCF-7細胞中培養30min后，用PBS緩沖溶液(pH＝7.4)沖洗，在雙光子熒光共聚焦顯微鏡下成像，在960nm激發下，熒光發射收集范圍510-560nm；圖b是MCF-7細胞的明場；圖c是圖a和圖b的疊加圖。五、具體實施方式下面通過實施例對本專利技術作進一步說明。實施例1：熒光探針分子Lyso-NP的合成將化合物1(3.89g)、1，4-二甲胺基苯乙炔(1.74g)、三苯基膦二氯化鈀(0.1g)和碘化亞銅(0.5g)加入到反應器中，然后加入三乙胺(3.66g)和N-甲基吡咯烷酮(20ml)，升溫至80℃反應12h；反應結束后過濾，將濾液蒸發干燥得粗產物，再用柱層析色譜柱分離(以乙酸乙酯/石油醚＝1/2作為洗脫液，v/v)，得到目標產物3.64g(8.03mmol)，收率80％。所述化合物1的結構式為：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.76(d,J＝8.3Hz,1H),8.62(d,J＝7.1Hz,1H),8.52(d,J＝7.7Hz,1H),7.88(d,J＝7.7Hz,1H),7.81(t,J＝7.8Hz,1H),7.55(d,J＝8.8Hz,2H),6.71(d,J＝8.8Hz,2H),4.38(t,J＝6.9Hz,2H),3.73(s,4H),3.05(s,6H),2.78(s,2H),2.72–2.61(m,4H).13CNMR(100MHz,CDCl3):δ164.23,163.94,150.83,133.32,132.86,131.55,131.46,130.67,129.82,129.11,128.26,127.08,120.83,111.78,108.52,101.91,85.25,66.78,56.10,53.69,40.15,29.71.實施例2：熒光探針分子的熒光測試及雙光子測試將本專利技術熒光探針溶于DMSO中制得1mM的母液，取100μL的該母液于10mL容量瓶中，再用不同體積比的甘油/水混合溶液(甘油與水的體積比分別為50:50、60:40、7本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針，其特征在于其結構式如下：

【技術特征摘要】
1.一種溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針，其特征在于其結構式如下：2.一種權利要求1所述的溶酶體靶向的雙光子黏度熒光探針的制備方法，其特征在于包括如下步驟：將化合物13.89g、1，4-二甲胺基苯乙炔1.74g、三苯基膦二氯化鈀0.1g及碘化亞銅0.5g加入到反應器中，然后加入三乙胺3.66g和N-甲基吡咯烷酮20ml，升溫至80℃反應12h；反應結束后過濾，將濾液蒸發干燥得粗產物，所得粗產物再用柱層析色譜柱分離，得到目標產物；所述化合物1的結構式為：3.根據權利要求2所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孟祥明，寧鵬，倪燕，李晨晨，岳平，馮燕，
申請(專利權)人：安徽大學，
類型：發明
國別省市：安徽,34