一株生防內生真菌-鏈格孢菌制造技術

本發明專利技術涉及微生物技術領域，本發明專利技術所述的樟樹內生真菌是從浙江杭州天目山采集的樟樹植物活體中采用內生真菌分離技術分離獲得的，經微生物分類學鑒定，命名為鏈格孢菌(Alternaria?alternata)31，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登記號CGMCC?No.4508。本發明專利技術最顯著的特征是該菌株液體發酵能夠產生對植物真菌病害病原菌如黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia?solani)、西瓜枯萎病菌(Fusarium?oxysporium)和番茄灰霉病菌(Botrytis?cinerea)等有抑制作用的活性代謝產物，是農業上重要的微生物資源。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物
，特別是涉及生防內生真菌一鏈格孢菌 (Alternariaalternata)的培養及其代謝產物的應用。
技術介紹
植物體內都存在大量的內生真菌，內生真菌最早發現于牧草，后來又在木本植物、 草本植物、禾本植物、苔蘚、地衣、海藻等植物中被發現。迄今的研究表明，植物內生真菌可增強宿主的抗病性、提高植物的生產力、抗逆抗蟲等。發揮這些作用是由于內生真菌在植物體內繁殖和生長，并在體內產生有生物活性的次生代謝產物。因此，內生真菌可能成為生物防治中有潛力的生物控制劑，在生態農業和生物農藥研制方面具有重要的用途。近年來植物內生真菌已引起了微生物學家、生態學家、植物保護學家的廣泛興趣，逐漸成為國內外研究的熱點。目前微生物源生物化學農藥的研究和開發在我國十分活躍，但微生物資源及其應用潛力尚沒有得到充分的發揮，而植物內生真菌即是這樣一類有待開發的新興微生物資源。目前對植物病害的防治，主要采用化學農藥殺滅病原菌，但化學農藥對人畜的毒副作用和殘留問題至今仍難以有效的解決。利用內生真菌產生的抗病原真菌的活性物質進行植物病原真菌病害的生物防治，則具有周期短、易于研究、便于生產和低毒等優點。本專利技術從樟樹中分離到一株生防內生真菌，并對該菌株發酵代謝產物進行了抑菌作用研究。該專利技術為微生物源農藥的進一步研制和開發提供優良的出發菌株。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對化學農藥不安全與微生物源農藥種類較少的不足，提供一種從樟樹中分離篩選出的內生真菌-鏈格孢菌(Alternaria alternate)；本專利技術的另一目的是提供利用該菌株代謝產物防治植物真菌病害的方法。本專利技術鏈格孢菌的分離、篩選與鑒定是于2008年6月在浙江杭州天目山采集的樟樹莖中，經分離、純化、培養、發酵和活性測定等步驟獲得并保存；經微生物分類學鑒定為鏈格孢菌(Alternaria alternate)， 定名為鏈格孢菌(Alternaria alternate) 31。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登記號CGMCC No. 4508。鏈格孢菌31，其固體培養特征為菌落在PDA平板上培養6-7天擴展至直徑為9cm，初期淺灰色稀疏，菌絲沿培養基表面匍匐生長，中間灰黑色，邊緣灰白色，反面黑色， 菌絲具隔，分枝。顯微形態特征分生孢子梗單生；分生孢子橢圓形，圓形。本專利技術所述的鏈格孢菌31，經發酵提取可獲得對部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代謝產物。本專利技術目的通過以下技術方案來實現一種防治黃瓜立枯病、番茄灰霉病或西瓜枯萎病等植物真菌病害微生物代謝產物的制備方法，按以下步驟進行(1)菌種的活化培養將分離保存的鏈格孢菌31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在士 1°C條件下培養，至菌絲覆蓋整個培養皿，用直徑為4mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；(2)發酵培養發酵培養液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，可溶性淀粉 20g，麩皮 10g，蛋白胨 8g，NH4N033g, (NH4) 2S045g, CaC035g, MgSO4Ig,每 300mL 三角瓶裝發酵培養液60mL ；配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取1直徑為4mm 菌餅，在士 1°C條件下，搖床轉速180轉/分鐘，發酵培養12 ；(3)發酵物提取發酵完畢，離心收集發酵上清液，用常規有機溶劑萃取經真空濃縮后獲得浸膏，用于抑菌活性測定。本專利技術的有益效果一是本專利技術從植物樟樹莖中分離篩選出代謝物對部分植物真菌病害病原菌具有較強抑制作用的鏈格孢菌31，這為農業上防治植物真菌病害病原菌提供了一種微生物菌株；二是本專利技術提供了利用鏈格孢菌31發酵獲得活性代謝產物的方法；該代謝產物可應用于植物真菌病害的防治，為農用殺菌劑的開發增添了新的途徑。具體實施例方式實施例1 (鏈格孢菌31的分離與篩選)本專利技術于2008年6月在浙江杭州天目山采集樟樹莖，經表面消毒、內生真菌分離、 培養、發酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌活性菌株的篩選等步驟，從中獲得鏈格孢菌31，保存。鏈格孢菌31抑菌活性測定取經0. 22 μ m膜過濾的發酵上清液ImL于無菌培養皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養基迅速混勻，冷卻后在每個培養基平面分別放1個直徑為4mm的黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)或西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium) 或番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)等供試菌菌餅，菌餅接于培養皿中央(培養皿直徑為 9cm)，置培養箱中培養72h，以無菌水處理作為對照，重復3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率權利要求1. 一種鏈格孢菌菌株，其特征在于，命名為鏈格孢菌(Alternaria alternate) 31，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日2010年12月31日，保藏登記號為 CGMCC No. 4508。全文摘要本專利技術涉及微生物
，本專利技術所述的樟樹內生真菌是從浙江杭州天目山采集的樟樹植物活體中采用內生真菌分離技術分離獲得的，經微生物分類學鑒定，命名為鏈格孢菌(Alternaria alternata)31，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登記號CGMCC No.4508。本專利技術最顯著的特征是該菌株液體發酵能夠產生對植物真菌病害病原菌如黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium)和番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)等有抑制作用的活性代謝產物，是農業上重要的微生物資源。文檔編號C12R1/645GK102191184SQ20111008819公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月8日 優先權日2011年4月8日專利技術者俞曉平, 申屠旭萍, 董勝張, 邊亞琳, 郝培應, 馬正 申請人:中國計量學院本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種鏈格孢菌菌株，其特征在于，命名為鏈格孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ?。幔欤簦澹颍睿幔簦幔常?，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日：２０１０年１２月３１日，保藏登記號為ＣＧＭＣＣ?。危铮矗担埃浮?

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：申屠旭萍，俞曉平，董勝張，郝培應，邊亞琳，馬正，
申請(專利權)人：中國計量學院，
類型：發明
國別省市：86