通用病毒樣顆粒(VLP)流感疫苗制造技術

在此描述了流感病毒樣顆粒(VLP)，它們在其表面上展示出一種或多種截短、重新工程化或重塑的HA分子。還描述了制造和使用這些VLP的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】通用病毒樣顆粒(VLP)流感疫苗相關申請的交叉引用本申請要求均于2010年2月18日提交的美國臨時申請號61/305,768和61/305,759，其披露內容通過引用結合在此。關于聯邦資助的研究的聲明不適用。
在此描述了包含抗原性流感蛋白的病毒樣顆粒(VLP)，以及制造和使用這些VLP的方法。
技術介紹
流感病毒(甲型、乙型以及丙型)是人類以及其他哺乳動物以及鳥類中的呼吸道感染的致病因子。病毒生命周期中的獨特的生物學以及流行病學特征驅使新病毒株的快速抗原進化和不斷出現，特別是甲型病毒的新病毒株。抗原變體的這種不斷出現導致了季節性流感流行以及以不規則間隔的全球大流行。每年的流感流行僅在美國就造成大約36,000人死亡，并且每年全世界的死亡人數超過250,000，同時造成了巨大的健康和經濟負擔。流感大流行對于人類的健康造成了嚴重威脅，并且像1918年大流行這樣的全球事件造成了據估計5千萬例的死亡以及破壞性的社會經濟影響。流感病毒具有單鏈、分段的RNA基因組，并且是正粘病毒科的成員。甲型流感病毒在病毒顆粒的表面上展示兩種主要糖蛋白，即血凝素(HA)以及神經氨酸酶(NA)，并且基于這兩種分子的抗原特性，它們被分成16種HA亞型(H1-H16)和9種NA亞型(N1-N9)。流感病毒感染之后的主要免疫應答靶向表面糖蛋白HA和NA。針對HA的抗體能夠阻斷病毒結合至細胞表面受體，并防止病毒進入和感染。然而，隨著時間的過去，這種應答變得無效，并且不能針對由于抗原性漂移(突變的積累)或者抗原性轉變(由于重配造成的交換片段)而引起出現抗原變體進行保護。目前，用于控制季節性或大流行性流感疾病的一種最有效的干預是預防接種。這種實踐要求易感受試者每年接收一定劑量的用最近的人病毒分離物配制的疫苗。這樣的疫苗通常由單獨的病毒制備，每一種病毒在雞胚中或者培養細胞中生長，并且然后混合于最終疫苗制劑中以便提供較寬的覆蓋范圍。由于流感病毒的快速抗原變異，疫苗必須定期重新配制以便結合出現的抗原變體，從而維持疫苗保護效力。因此，疫苗的有效性取決于疫苗與人體內循環的病毒株之間的抗原相似性程度。此外，一定比例的接種個體，包括老年人，在使用當前疫苗的情況下不能產生保護性免疫。最近用噬菌體展示抗體文庫進行的一項研究已經鑒定出廣泛中和性抗體，它們能夠阻斷廣譜的流感病毒亞型導致的感染(JianhuaSui等人(2009)Nat.Structural&Mol.Biol.16:265-273)。這些抗體中和光譜的病毒的能力由以下作用產生：與HA分子的干區中存在的亞優勢并且高度保守的表位反應，通過抑制膜融合而不是通過阻止由于病毒感染或接種誘導的主要中和機制的受體結合來阻斷感染。對展顯示了這些亞優勢并且高度保守的表位的疫苗的設計將引出能夠針對廣譜的流感亞型進行保護的廣泛中和性免疫應答。為了產生用于配制目前疫苗所需要的病毒組分，所選擇的病毒通過感染雞胚或培養細胞而生長。這個過程取決于病毒的經由HA分子附著至細胞表面上的含有唾液酸的受體的能力、侵入、病毒復制以及病毒子代從雞胚或培養細胞的液體中的分離。將病毒HA截短、重新工程化或重塑將消除受體結合并且排除病毒復制并且產生這樣一種疫苗。通過同時表達2種、3種或4種病毒基因(M1、M2、HA以及NA)來產生流感VLP，其中M1、M2或(類似基質蛋白)HA以及NA是該結構的主要和基本組分。參見例如美國專利公開號20080031895和20090022762。編碼這些基因的DNA序列同時或依次轉染至細胞中，在細胞中它們被轉錄并且翻譯成它們對應的蛋白質，這些蛋白質自組裝成病毒樣顆粒。與病毒相反，針對受體結合和病毒侵入的HA區域的修飾并不干擾VLP在細胞中的產生、組裝或釋放。也就是說，VLP的產生允許帶有分子的免疫優勢和遺傳可變區的HA的主要部分的缺失和重塑，而病毒復制方法并不允許這些修飾。也可以在NA分子上引入相似的修飾，該NA分子也展示在VLP疫苗的表面上。然而，對于流感疫苗組合物以及制造和使用這類組合物的方法仍然存在著需要。
技術實現思路
在此描述了包含至少一個截短的和/或雜合流感抗原蛋白(例如HA或NA)的病毒樣顆粒(VLP)。還描述了包含這些VLP的組合物，以及制造和使用這些VLP的方法。在此描述的VLP沒有病毒遺傳物質，并且因此不會復制或導致感染；然而在假定它們與野生型病毒粒子的形態、生物化學以及抗原相似性的情況下，VLP具有高度免疫原性，并且能夠引出強烈的保護性免疫應答。不同于基于病毒粒子滅活的疫苗，VLP不具有傳染性，由此消除了化學處理的需要，因而保留了天然構象。此外，本專利技術通過提供針對當前的以及演化的流感病毒的廣泛保護，克服了與每個季節重新配制流感疫苗相關的問題。因此，在一方面，在此披露的是一種病毒樣顆粒(VLP)，該病毒樣顆粒包括在此提供的包含至少一種基質蛋白(例如流感基質蛋白如M1、托高土(thogoto)基質蛋白以及RSV基質蛋白)；以及修飾的流感多肽(例如糖蛋白如HA或NA)的病毒樣顆粒(VLP)，其中該修飾包括流感(例如HA)多肽的跨膜以及胞質尾區外部的一個或多個氨基酸殘基的缺失。在某些實施方案中，缺失包括至少150個連續氨基酸殘基的缺失。在其他實施方案中，缺失包括一個以上的非連續缺失。仍然在其他實施方案中，流感多肽(例如HA)包含一個或多個氨基酸突變(置換和/或添加)，例如其中至少一個溶蛋白性裂解位點和/或至少一個連接物被插入修飾的流感多肽(例如HA)中的實施方案。該連接子可以是已知的連接序列，或者可以從頭產生以用于在此描述的分子中。在此處披露的任何VLP中，VLP可以是多價的，即可以包含多種流感抗原蛋白，包括在此描述的野生型和/或修飾的流感多肽的任何組合。另外，在此處描述的任何VLP中，修飾的流感(例如HA或NA)多肽的跨膜和/或胞漿區被替換為來自與修飾的流感多肽不同的毒株或亞型的跨膜和/或胞漿區。此外，在此描述的任何VLP可以進一步包含另外的流感蛋白，例如一種或多種另外的野生型基質蛋白(M1和/或M2)、一種或多種另外的修飾的(突變和/或雜合)基質蛋白(M1和/或M2)、一種或多種野生型抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一種或多種雜合抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一種或多種修飾的抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一種或多種雜合并修飾的抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一種或多種核蛋白(NPs)、一種或多種PB1蛋白、一種或多種PB2蛋白、一種或多種PA蛋白以及它們的組合。在某些實施方案中，VLP的多價性在于一種以上抗原性糖蛋白(修飾的糖蛋白或野生型糖蛋白的任何組合)表達在VLP的表面上(例如以便產生免疫應答)。在此描述的任何VLP可以在允許VLP組裝和釋放的條件下表達在真核細胞(例如酵母細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、鳥類細胞、植物細胞或哺乳動物細胞)中。在另一方面，在此描述的是包含以上描述的任何VLP的宿主細胞。在某些實施方案中，宿主細胞允許在此描述的VLP在編碼VLP多肽的一種或多種載體中的組裝以及從其釋放。在某些實施方案中，真核細胞選自下組，該組由以下各項組成：酵母細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、鳥類細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。在又一方面，在此提供產生在此描述的任何VLP的方法，本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.02.18 US 61/305,768;2010.02.18 US 61/305,7591.一種病毒樣顆粒VLP，包含流感M1蛋白和M2蛋白；以及一種修飾的流感HA多肽，其中該修飾的流感HA多肽選自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10所組成的組。2.如權利要求1所述的VLP，其中該VLP在允許VLP的組裝以及釋放的條件下在一種真核細胞中表達。3.如權利要求2所述的VLP，其中該真核細胞選自下組，該組由以下各項組成：酵母細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、鳥類細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。4.一種產生根據權利要求1至3中任一項所述的VLP的方法，該方法包括以下步驟：將一種或多種載體轉染至適合的宿主細胞中，并且在允許形成VLP的條件下表達蛋白質的組合，所述一種或多種載體包括編碼以下物質的序列：流感M1蛋白和M2蛋白，以及選自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQI...

【專利技術屬性】
技術研發人員：喬斯·加拉爾薩，喬治·R·馬丁，
申請(專利權)人：泰科諾瓦有限公司，
類型：
國別省市：