一種抗癌藥物的制備方法技術

本發明專利技術提供了一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于：選擇雞胚成纖維細胞，接種新城疫病毒，經過培養收獲病毒液，收獲后的病毒液經過超濾濃縮，將膜上濃縮液通過柱層析純化，最終將膜下的有效成份和純化病毒混合得到一種抗癌藥物。本發明專利技術的產品能夠通過提高機體免疫力等多種機制發揮其強大的抗腫瘤作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物醫藥
，尤其是。
技術介紹
新城疫病毒(NDV)為副粘病毒科副粘病毒屬成員，能夠引起禽類發生急性傳染病，對養禽業的危害極大。NDV有時感染人，主要引起人的急性結膜炎，偶爾也可以侵害角膜，個別病人出現流感樣癥狀，大多數病人不經治療，7 IOd自行康復，且不傳染給別人。NDV治療患瘤病人的安全性高，對人的危害小。NDV抗腫瘤作用主要表現在三個方面，病毒可促進宿主產生細胞因子，如IFN，TNF，IL等；NDV可直接對腫瘤細胞產生細胞毒作用，加強 腫瘤抗原的免疫原性，通過宿主免疫機制殺傷腫瘤細胞；NDV可激活患瘤機體的免疫細胞，活化免疫細胞對腫瘤細胞的毒性作用。因此，通過提高病毒純度，減少病毒中卵清蛋白等雜蛋白，制備出對人體副作用少而抗癌作用顯著的制劑，具有非常重要的應用價值和經濟價值。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于提供上述抗癌藥物的制備方法。為解決上述技術問題，本專利技術的技術方案是一種抗癌藥物，是由下述方法得到的接種新城疫病毒之后，收取的病毒液，經過超濾濃縮后，再進行純化，除菌過濾后獲得該抗癌藥物。上述抗癌藥物，所述方法的具體步驟為(I)雞胚成纖維細胞制備選擇良好的雞胚取9 10日齡雞胚，用新潔爾滅消毒蛋殼10分鐘后放凈化臺。用碘酒、酒精消毒蛋殼。用鑷子打開氣室。用另一套鑷子將殼膜打開將雞胚夾起去頭、爪、眼，放滅菌生理鹽水中。 把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30分鐘。剪切用眼科剪把組織切成I. 5毫米大小的塊，以便于消化。處理組織將已剪碎的組織碎片倒入一個帶玻璃珠的滅菌三角瓶中，其中加入O.25%的胰酶，10個胚約7ml，或加組織消化液，一個胚Iml (組織消化液以及胰酶的配置見微生物指導)結扎瓶口或塞以膠塞。消化將其置入37°C水浴箱中或用恒溫水浴，消化中應不停搖動，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。消化10 15分鐘。一般約12分鐘。視雞胚日齡大小而定。越小消化時間越短。見組織松軟即可。一般不可消化時間太長否則容易導致細胞活力不足。分離在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在倒置顯微鏡鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，加入含5%犢牛血清雙抗的的水解乳蛋白Hanks液少許。用力震搖，或用吸管吹打，使細胞分散，脫落。然后用紗布過濾，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速(500 1000轉/分)離心消化液5分鐘，吸出上清(可以不離心吸掉上清)，加入適量含有血清的培養液。將培養瓶置入0)2細胞培養箱中，37°C、5% C02。瓶口用螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，培養24小時進行觀察。一般在24 48小時可形成單層細胞。(2)病毒接種取培養24小時以上的的細胞，加入O. 2ml新城疫病毒，換維持液繼續培養72小時。培養溫度33 35 °C。(3)病毒收獲取來培養72小時的細胞瓶，鏡下觀察有無病變產生，將有病變的細胞在_20°C凍·融多次，使病毒完全釋放，收獲含有病毒細胞懸液。(4)超濾在無菌環境下通過超濾系統對病毒液超濾濃縮至原來的10倍，其中超濾膜包截留分子量為lOOKd。(5)純化無菌條件下取步驟(4)收集超濾后的病毒液，將膜上的病毒液打入層析柱中進行純化，用PBS進行洗脫，收集病毒峰，所得純化后的新城疫病毒液。(6)混合無菌條件下取步驟(5)純化后的病毒液與超濾后的膜下有效成份相混合，除菌過濾后得到一種新的抗癌藥物。本專利技術所述的抗癌藥物純度高，而病毒液中卵清蛋白等雜蛋白少，大大減小了該制劑對人體的副作用，從而大大提高了該藥物的抗腫瘤作用；所述制備方法可有效提高病毒純度，減少病毒中卵清蛋白等雜蛋白，制備方法簡單，大大降低了生產成本，適合規模化工業生產的需要。具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術所述技術方案作進一步的說明。具體實施例I一、雞胚成纖維細胞的制備選擇良好的雞胚取9日齡雞胚，用新潔爾滅消毒蛋殼10分鐘后放凈化臺，用碘酒、酒精消毒蛋殼。用鑷子打開氣室。用另一套鑷子將殼膜打開將雞胚夾起去頭、爪、眼，放滅菌生理鹽水中。把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30分鐘。剪切用眼科剪把組織切成I. 5毫米大小的塊，以便于消化。處理組織將已剪碎的組織碎片倒入一個帶玻璃珠的滅菌三角瓶中，其中加入O.25%的胰酶，10個胚約7ml，或加組織消化液，一個胚Iml (組織消化液以及胰酶的配置見微生物指導)結扎瓶口或塞以膠塞。消化將其置入37°C水浴箱中或用恒溫水浴，消化中應不停搖動，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。消化10 15分鐘，一般約12分鐘，視雞胚日齡大小而定。越小消化時間越短，見組織松軟即可。一般不可消化時間太長，否則容易導致細胞活力不足。分離在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在倒置顯微鏡鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化。加入含5%犢牛血清雙抗的的水解乳蛋白Hanks液少許,用力震搖或用吸管吹打,使細胞分散,脫落,然后用紗布過濾，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速1000轉/分離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液。 將培養瓶置入0)2細胞培養箱中，37°C、5% C02。瓶口用螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，培養24小時進行觀察，一般在24 48小時可形成單層細胞。二、病毒接種取培養24小時以上的的細胞，加入O. 2ml新城疫病毒，換維持液繼續培養72小時，培養溫度33 35°C。三、病毒收獲取來培養72小時的細胞瓶，鏡下觀察有無病變產生，將有病變的細胞在_20°C凍融多次，使病毒完全釋放，收獲含有病毒細胞懸液。四、超濾濃縮在無菌環境下通過超濾系統對2500ml病毒液超濾濃縮至原來的10倍，其中超濾膜包截留分子量為lOOKd，最后得到膜上濃縮液250ml，膜下1750ml。五、純化將濃縮后超濾膜膜上250ml病毒液移入無菌器皿，在無菌條件下將病毒液打入層析柱中，通過凝膠介質對樣品進行層析純化，獲得純化后的病毒樣品750ml。六、合并將純化后的病毒液750ml與IOOKd膜下有效成份1750ml混合，除菌過濾后得到一種抗癌藥物。具體實施例2一、雞胚成纖維細胞的制備選擇良好的雞胚取10日齡雞胚，用新潔爾滅消毒蛋殼，放入凈化臺。用碘酒、酒精消毒蛋殼。用鑷子打開氣室。用另一套鑷子將殼膜打開，將雞胚夾起去頭、爪、眼，放滅菌生理鹽水中。用Hanks液漂洗3次，去除血污。用眼科剪把組織切成I. 5毫米大小的塊，加入O. 25%的胰酶消化，消化約12分鐘。低速1000轉/分離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液。CO2細胞培養箱中培養，一般在24 48小時可形成單層細胞。二、病毒接種取培養24小時以上的的細胞，加入O. 2ml新城疫病毒，換維持液繼續培養72小時，培養溫度33 35°C。三、病毒收獲取來培養72小時的細胞瓶，鏡下觀察有無病變產生，將有病變的細胞在_20°C凍融多次，使病毒完全釋放，收獲含有病毒細胞懸液。四、超濾濃縮在無菌環境下通過超濾系統對5000ml病毒液超濾濃縮至本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于：制備雞胚成纖維細胞，用新城疫病毒接種雞胚成纖維細胞，經過培養收獲病毒液，收獲的病毒液經過100K膜包超濾濃縮，超濾后的膜上樣品再通過柱層析純化，將超濾膜下的有效成份和純化后的病毒樣品等量混合，經除菌過濾后獲得一種抗癌藥物。

【技術特征摘要】
1.一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于制備雞胚成纖維細胞，用新城疫病毒接種雞胚成纖維細胞，經過培養收獲病毒液，收獲的病毒液經過IOOK膜包超濾濃縮，超濾后的膜上樣品再通過柱層析純化，將超濾膜下的有效成份和純化后的病毒樣品等量混合，經除菌過濾后獲得一種抗癌藥物。2.根據權利要求I所述的抗癌藥物，其特征在于 (1)雞胚成纖維細胞制備 通過選擇良好的雞胚、剪切、處理組織、消化、分離、培養等步驟進行制備雞胚成纖維細胞。(2)病毒接種 取培養24小時以上的的細胞按一定比例加入新城疫病毒，換維持液培養。(3)病毒收獲將在倒置顯微鏡鏡下觀察有病變的細胞，在_20°C凍融多次，收獲細胞懸液。(4)超濾濃縮 在無菌環境下通過超濾系統對步驟(3)的病毒液超濾濃縮，其中超濾膜包截留分子量為 IOOKd0 (5)純化 在無菌條件下將步驟(4)中濃縮后超濾膜膜上病...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙鋼，
申請(專利權)人：天津濟命生生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：