一種靶向抑制POLD1基因表達的siRNA序列制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種靶向抑制人POLD1基因表達的siRNA序列，所述siRNA序列的正義鏈和反義鏈的3’端均以UU或dTdT為懸垂修飾，將本發(fā)明專利技術(shù)作用于腫瘤細胞，檢測POLD1基因被POLD1siRNA抑制后，腫瘤細胞在增殖、運動轉(zhuǎn)移及細胞周期方面的變化，經(jīng)實時熒光定量PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測，發(fā)現(xiàn)POLD1siRNA1、POLD1siRNA4可顯著下調(diào)POLD1?mRNA及蛋白水平的表達，并在人小細胞肺癌NCI-H446細胞上驗證了設(shè)計合成的POLD1?siRNA對腫瘤細胞增殖、運動轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的影響，為POLD1?siRNA臨床應(yīng)用于腫瘤的治療奠定基礎(chǔ)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
—種靶向抑制P0LD1基因表達的siRNA序列
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種靶向抑制POLDl基因表達的siRNA序列。
技術(shù)介紹
DNA復(fù)制是細胞正常分裂、增殖的關(guān)鍵一步。DNA聚合酶δ (ρο δ )是真核生物DNA復(fù)制的最主要復(fù)制酶，在哺乳動物細胞中，ρο δ由4個亞基組成，分別是ρ125、ρ50、ρ68、ρ12。ρ125亞基是它的催化亞基，具有5' -3'聚合酶活性和3' -5'核酸外切酶活性，這使該酶在DNA復(fù)制、修復(fù)、維持基因組穩(wěn)定性、重組及細胞周期調(diào)控中都起到重要作用。癌的惡性增殖需要DNA的大量復(fù)制滿足其持續(xù)的細胞分裂活動。近年來，ρο δ與細胞癌變之間的關(guān)系逐漸被研究者重視。國內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，Ρ125的表達與肝腫瘤的惡性程度、腫瘤細胞分化程度、靜脈侵襲和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ρ125高表達的肝癌細胞系Ifep3B和H印G2 的侵襲能力明顯強于P125低表達的Huh7細胞系。pl25的表達與POLDlmRNA(P0LDI是編碼DNA聚合酶δ催化亞基ρ125的基因)表達呈正相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄水平上沉默POLDl基因表達，能明顯降低肝癌細胞的侵襲能力。POLDl基因是多種增殖性調(diào)控基因最終產(chǎn)生效應(yīng)的基因，也可能自身的變化就是細胞癌變的重要原因。在肝癌細胞H印G2中，POLDl基因的第472密碼子由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸；乳腺癌易感基因BRCA1/2的熱點突變區(qū)就潛伏在POLDl基因上；P0LD1基因的突變使乳腺癌的發(fā)生率增加了 2倍。在小鼠體內(nèi)將POLDl基因一個等位基因的ExoII功能區(qū)D400位點突變后，能夠誘發(fā)小鼠淋巴癌及上皮癌。此外，在結(jié)腸癌、宮頸癌中也發(fā)現(xiàn)了 POLDl基因的高表達。因此，通過進一步研究闡明POLDl基因表達或pl25功能活性被抑制后直接阻斷癌細胞增殖的機理，分離鑒定阻斷癌細胞異常增殖的有效作用靶點，為新藥開發(fā)提供最確切的理論依據(jù)。小RNA干擾(small interference RNA, RNAi)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種阻抑基因表達的新方法。RNAi作用的高度特異性，有可能特異地抑制致病的突變等位基因，但又不影響正常等位基因功能，所以RNAi在基因治療上有廣闊的應(yīng)用前景。RNAi作用機制是雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細胞后，在Dicer酶的作用下，降解為21_23bp，3’端帶有2個突出堿基的siRNA,并與細胞內(nèi)核酸內(nèi)外切酶、解鏈酶、Argonaute蛋白等結(jié)合,形成具有多個亞單元的核糖核苷酸蛋白復(fù)合物-RISC(RNA-inducing silencing complex),高效遞進式介導(dǎo)細胞內(nèi)源性的同源mRNA的降解。哺乳動物細胞內(nèi)，導(dǎo)入長雙鏈RNA可導(dǎo)致基因表達廣泛抑制，直接應(yīng)用短雙鏈的siRNA同樣高效介導(dǎo)RNAi，并避免非特異性基因抑制效應(yīng)。且短雙鏈siRNA通過化學(xué)方法易合成，操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高，對細胞的或者組織的毒副作用小，可大規(guī)模制備，臨床應(yīng)用方便，在藥物開發(fā)方面具有不可替代的優(yōu)勢。但是，由于siRNA的堿基分布，兩端自由能大小及靶mRNA的二級結(jié)構(gòu)等因素的影響，靶向同一基因mRNA不同靶點的siRNA，封閉基因表達的效果明顯不同。在siRNA沉默特定基因的實驗中，為保證siRNA能高效降解靶mRNA，一般需要針對靶基因設(shè)計合成多條不同序列的siRNA，從中篩選出有效序列。有效siRNA序列的設(shè)計篩選是siRNA介導(dǎo)RNAi實驗的關(guān)鍵點之一。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題在于提供一種靶向抑制人POLDl基因表達的siRNA序列，能聞效抑制POLDl基因的表達，從而抑制腫瘤的生長、增殖和運動轉(zhuǎn)移，促進腫瘤細胞死亡。本專利技術(shù)是這樣實現(xiàn)的一種靶向抑制人POLDl基因表達的siRNA序列，所述siRNA序列包括下述八條序列中的至少一條POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA3 序列，其正義鏈為 5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反義鏈為5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，；P0LDlsiRNA5 序列，其正義鏈為 5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反義鏈為5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，；P0LDlsiRNA6 序列，其正義鏈為 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反義鏈為5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，；P0LDlsiRNA7 序列，其正義鏈為 5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反義鏈為5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，；P0LDlsiRNA8 序列，其正義鏈為 5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反義鏈為5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。進一步地，所述siRNA序列包括以下三條序列POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。進一步地，所述siRNA序列包括以下兩條序列POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。本專利技術(shù)具有如下優(yōu)點首先，POLDl基因是腫瘤基因治療的良好靶點，應(yīng)用siRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)可以比以往的任何手段更高效、特異、方便的抑制靶基因的表達。本專利技術(shù)提供能高效抑制POLDl基因表達的siRNA序列，并作用于腫瘤細胞，檢測POLDl siRNA抑制POLDl基因表達后，腫瘤細胞在增殖、運動轉(zhuǎn)移、細胞周期等方面的變化，為POLDl siRNA應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療奠定重要基礎(chǔ)。其次，本專利技術(shù)提供能高效抑制POLDl基因表達的siRNA序列，為POLDl基因功能的進一步研究奠定重要基礎(chǔ)，從而抑制腫瘤的生長、增殖和運動轉(zhuǎn)移，促進腫瘤細胞死亡。通過研究癌細胞中對POLDl基因癌性表達和pl25功能活性癌性表現(xiàn)的抑制，尋找癌細胞增殖阻斷的靶點，為發(fā)展最有效的新的抗癌或抗細胞增殖性疾病藥物提供理論基礎(chǔ)。附圖說明下面參照附圖結(jié)合實施例對本專利技術(shù)作進一步的說明。圖I為MTT法檢測POLDlsiRNA抑制癌本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種靶向抑制人POLD1基因表達的siRNA序列，其特征在于：所述siRNA序列包括下述八條序列中的至少一條：POLD1siRNA1序列，其正義鏈為5’CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈5’為AUCUAUGGCUGAUGGUGGG3’；POLD1siRNA2序列，其正義鏈為5’GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5’AUAAUGGUCAAUCUCCAAC3’；POLD1siRNA3序列，其正義鏈為5’CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反義鏈為5’AUGAUACGGAUGAAGGUGG3’；POLD1siRNA4序列，其正義鏈為5’CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5’UUCUGGAUGUUGUAACCGG3’；POLD1siRNA5序列，其正義鏈為5’CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反義鏈為5’UUUGUACCUUGAGGGUCUG3’；POLD1siRNA6序列，其正義鏈為5’GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反義鏈為5’UGAACUGAUCCUCAGUCAGGC3’；POLD1siRNA7序列，其正義鏈為5’GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反義鏈為5’UGUGUACUUAGACUCCACC3’；POLD1siRNA8序列，其正義鏈為5’GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反義鏈為5’UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3’。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：許瑞安，張均平，
申請(專利權(quán))人：華僑大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：