提供了通過表達重組微小RNA前體，調節植物中的靶基因表達的方法。也提供了所述重組微小RNA前體用于控制線蟲，特別地控制大豆孢囊線蟲的用途。還提供了將遺傳材料導入易感線蟲的植物中從而增加對線蟲的抗性的方法。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】新型微小RNA前體及其在調控靶基因表達中的用途摘要本申請是植物分子生物學的領域并提供了通過表達重組微小RNA前體來調節植物中的靶基因表達的方法。本申請還涉及此類重組微小RNA前體用于控制線蟲，特別是控制大豆孢囊線蟲的用途。本申請還涉及將遺傳材料導入到易感線蟲的植物中，從而增加對線蟲的抗性。專利技術描述植物中的基因表達是高度受控的機制，涉及的所有步驟均受調控。例如轉錄裝置對基因組DNA的可接近性或信使的穩定性調控。過去數年里顯示，RNA分子(例如信使RNA)的穩定性和可接近性受小干擾RNA(SiRNA)(例如微小RNA、ta-siRNA等)的高度調控。微小RNA是作為動物和植物中進化保守的、基于RNA的基因表達調控子出現的。微小RNA (約18至25nt)來自更大的前體——pre_miRNA，具有從非蛋白質編碼基因轉錄而來的莖環結構。目前已知植物微小RNA抑制大量在發育過程中有功能的基因的表達，表示基于微小RNA的調控與控制生長和發育的途徑是一個整體。抑制基因表達的植物微小RNA通常含有與靶位點接近完美的互補性，所述靶位點通常位于mRNA的蛋白質編碼區(Llave C等人，(2002) Science 297，2053-2056 ;Rhoades MW 等人，(2002) Cell 110，513-520)。結果是，在植物中，大部分的抑制基因表達的植物微小RNA在指導靶RNA切割中發揮功能(Jones-Rhoades MW 和 Bartel DP (2004)Mol. Cell 14，787-799 ;Kasschau KD 等人，(2003)Dev.Cell 4,205-217)。各種出版物描述了微小RNA的功能，及其通過在植物中過表達內源或重組微小RNA來作為下調靶基因表達的工具的用途。Ossowski等人，(2008)給出了使用人工 siRNA(例如微小RNA)沉默基因的方法的綜述。Schwab等人(2006)在擬南芥中顯示，當用于改造抑制靶基因時，并非所有的微小RNA前體都等同良好地用于沉默。例如，經過改造用于靶向相同靶基因的前體MIR319a和MIR172a表現出不同程度的對靶基因的下調，MIR319a更有效地沉默相應的靶基因。此外，良好地適合在一個物種中有效沉默靶基因的微小RNA前體可能不能在另一個物種中發揮同等良好的作用(Alvarez J P等人，2006植物細胞18 :1134-1151)。因此，本專利技術的一個已有的目標是提供其他的微小RNA前體，其通過遞送小調節RNA(如微小RNA、ta-siRNA、siRNA、激活RNA等)可用作植物中靶基因沉默的有效工具。本專利技術的另一個目標是提供這樣的微小RNA前體，所述微小RNA前體可用作大豆屬植物中，優選大豆(Glycinemax)中祀基因沉默的有效工具。此類重組微小RNA前體是例如用于調節參與植物和病原體(如線蟲)相互作用的基因的有效工具，從而預防感染和增加植物(如大豆)的病原體抗性。線蟲是以2000多種行栽作物、蔬菜、水果和觀賞植物為食的微小線蟲動物，在全世界引起大約I千億美元的作物損失。多種寄生線蟲物種感染作物植物，包括根癌線蟲(root-knot nematode) (RKN)、胞囊形成線蟲(cyst-forming nematode)和病變形成線蟲(lesion-forming nematode)。以在進食位點引起根蟲癭形成為特征的根癌線蟲,具有相對廣的宿主范圍并因此在多種作物物種上是致病的。胞囊形成線蟲和病變形成線蟲具有較為有限的宿主范圍，但是仍在易感作物中引起相當大的損失。致病線蟲目前遍及整個美國，在南部和西部的溫暖、潮濕區域以及在沙質土壤中發生最為密集。1954年，首次在美國北卡羅萊納州發現了大豆胞囊線蟲(Soybean cystnematode) (Heterodera glycines),其是大豆植物最嚴重的害蟲。一些地區受到大豆胞囊線蟲(SCN)侵染太嚴重，以至于不采取控制措施，大豆產量將不再是經濟上可行的。盡管大豆是受到SCN攻擊的主要經濟作物，但是SCN總共寄生大約50種宿主，包括大田作物、蔬菜、觀賞植物和雜草。線蟲損害的病征包括在炎熱時期葉子的矮化和黃化，以及植物枯萎。然而，線蟲感 染可以在沒有任何明顯的地上疾病癥狀的情況下引起顯著的產量損失。產量降低的主要原因是由于地下的根損傷。受到SCN感染的根會矮化或者發育不良。線蟲感染也可以減少根上固氮根瘤的數量，并可以使根更易于受到其他土傳植物病原體的攻擊。線蟲的生活史具有三個主要的階段卵、幼體和成體。線蟲物種之間生活史不同。例如，在最佳的條件下，SCN的生活史通常可以在24到30天內完成，然而其他物種可能需要I年或者更長以完成生活史。在春天，當溫度和濕度水平變得有利的時候，在土壤中，蟲狀的幼體從卵中孵化。只有在幼體發育階段的線蟲能感染大豆根。SCN的生活史是很多研究的主題，并且其是理解線蟲生活史的有用的實例。在滲透入大豆根后，SCN幼體移動穿過根直到它們接觸到維管組織，在那時，它們停止遷移并開始進食。通過口針，線蟲注射修飾某些根細胞的分泌物并將它們轉變成專門的進食位點。根細胞在形態上被轉化成作為線蟲的營養來源的大型多核合胞體(或者在RKN的情況下為巨大細胞)。因此,主動進食線蟲從植物中盜取基本營養物質,造成了產量損失。隨著雌性線蟲進食，它們開始膨大并最終變得太大以至于它們的身體突破了根組織并暴露于根的表面。在一段時間的進食后，沒有如成體膨大的雄性SCN線蟲，遷移到根的外面進入土壤中并使增大的成年雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍依附于根系統并繼續進食。在膨大的雌性內的卵開始發育，最初在體外的團塊(mass)或卵囊內，并然后隨后在線蟲體腔內。最終，整個成年雌性體腔都充滿了卵，且線蟲死去。死亡雌性的充滿卵的身體稱為胞囊。胞囊最終擴散并在土壤中可隨意發現。胞囊的壁變得非常堅硬，為包含在其中的大約200至400個卵提供良好的保護。SCN的卵在胞囊中存活直到合適的孵化條件出現。盡管許多卵可以在第一年內孵化，但是許多卵也會在保護性胞囊中存活幾年。線蟲在土壤中以其自身的能力每年僅可以移動幾英寸。然而，線蟲感染可以以多種方式傳播相當遠的距離。任何移動受感染土壤的東西都能傳播感染，包括農業機械、車輛和工具、風、水、動物和農場工人。土壤的種子大小顆粒常常污染收獲的種子。因此，當從受感染的田地的受污染的種子播種在未受感染的田地的時候，線蟲感染可以傳播。甚至有證據表明，某些線蟲物種可以通過鳥類傳播。這些原因中僅有一些可以預防。用于管理線蟲感染的常規方法包括在受線蟲感染的土地中保持合適的土壤營養和土壤pH水平；控制其他植物疾病，以及昆蟲和雜草害蟲；僅在耕種了未感染田地后使用衛生實踐，如線蟲感染田地的耕作、種植和栽培；在受感染的田地作業后，用高壓水或者蒸汽徹底清潔設備；不使用在受感染的土地上生長的種子用于種植未感染的田地，除非種子已經適當地清潔；輪作受感染的田地并用非宿主作物替換宿主作物；使用殺線蟲劑；和種植抗性植物品種。已經提出了用于植物的基因轉化的方法以賦予對植物寄生線蟲增加的抗性。美國專利號5，589，622和5，824，876涉及在受到線蟲附著后在植物的進食位點內或者附近特異表達的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：Y·王，L·W·塔爾頓，A·威格，P·任，
申請(專利權)人：巴斯夫植物科學有限公司，
類型：
國別省市：
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