雙峰駝角蛋白、編碼基因及其獲取方法技術

本發明專利技術涉及一種在雙峰駝角蛋白、編碼基因及其獲取方法，本發明專利技術中的雙峰駝角蛋白基因的cDNA序列是通過以雙峰駝耳部組織中總RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的角蛋白基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝角蛋白基因cDNA序列見SEQ?ID?NO.1。將雙峰駝角蛋白基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質編碼序列見SEQ?ID?NO.2。對包括SEQ?ID?NO.1在內的9個物種的九條角蛋白基因的CDS序列構建了系統發生樹，結果發現：雙峰駝角蛋白同牛和豬的進化距離最近，間接證明了所得到的序列確為雙峰駝角蛋白基因。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程
，特別是涉及一種在。
技術介紹
角蛋白(keratin)系硬蛋白之一，是一類具有結締和保護功能的結構纖維硬蛋白，存在于脊椎動物皮膚、毛發指甲等部位，富含半胱氨酸殘基和大量的二硫鍵。角蛋白可分為α角蛋白(a-keratin),主要存在于哺乳動物；和β角蛋白(β-keratin),主要分布于鳥類和爬行動物。哺乳動物有30種不同的角蛋白，可分為相對酸性和堿性兩類多肽。由處于α-螺旋或β-折疊構象的平行的多肽鏈組成不溶于水的起著保護或結構作用蛋白質。 研究發現，角蛋白是一種具有多種生物學功能的蛋白質。角蛋白是外胚層細胞的結構蛋白，包括毛發、指甲、羽毛等。是一種抗機械、抗化學刺激的蛋白質，存在于所有高等脊椎動物體中。角蛋白是一種不能直接為畜禽吸收利用的硬蛋白，主要存在于動物的毛發、羽毛和蹄之中，資源非常豐富，它必須經高溫、高壓、酸、堿或酶處理，變成短肽或游離氨基酸，才能被畜禽利用。角蛋白具有很強的抗牽伸性能，在動物體內起保護作用。角蛋白的研究，2009年，張俊珍等人對羊駝皮膚角蛋白基因家族的表達進行了研究，指出keratin家族有7個家庭成員表達，這些基因的表達對維持羊駝皮膚及其衍生物(毛發)的正常生理起著重要的作用。2010年，邢孟欣等人對遼寧新品系絨山羊角蛋白家族四個基因在皮膚中的表達及分析進行了研究，表明羊毛、羊絨的角蛋白組成和含量與其纖維的品質有密切關系。2011年，石國慶等人對角蛋白HGTP及其對羊毛發育的影響進行了研究，結果表明=HGTP家族成員KAP6、KAP7和KAP8基因表達對羊毛細度和彎曲等特性具有重要影響。在雙峰駝中，角蛋白是駱駝外胚層細胞上的蛋白質，對雙峰駝皮膚及其毛發的正常生理起關鍵的作用。駱駝絨毛中角蛋白的組成和含量與絨毛的品質有密切關系。因此，對駱駝角蛋白的研究將有助于細胞生物學的發展。
技術實現思路
一種雙峰駝角蛋白，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO. 2 所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或/和疊加一個或多個氨基酸衍生得到的，且與(a)編碼蛋白質具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。一種雙峰駝角蛋白編碼基因，其是與體內外胚細胞密切相關的基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO.1 所示序列；(b)由堿基簡并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且與 (a)編碼相同功能蛋白質的序列。本專利技術還提供了一種雙峰駝角蛋白基因的克隆和測序方法，該方法包括步驟(I) 組織分離(Isolation) ； (2)總RNA的分離(Total RNA isolation)包括①提取RNA的準備工作組織總RNA提取組織總RNA的鑒定。(3)全長cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括①引物設計及合成 ’②RT-PCR擴增；③克隆和測序，其PCR引物的正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGGCCACCCAGTTCTGCTCC-3’SEQ ID NO. 4 01igo dT ；上述從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA為將雙峰駝耳部組織放入裝有Trizol 的勻漿器管中勻漿，離心分離，吸取上清液，在15-30°C溫育5分鐘，加氯仿，劇烈震蕩，繼續在15-30°C溫育2-3分鐘，再次離心分離，吸取上清液，加異丙醇混合均勻，然后15-30°C溫育10分鐘，離心分離，所得沉淀物加75%乙醇洗滌，離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。分離提取后的總RNA用分光光度計測定RNA含量和用瓊脂糖電泳分析RNA的質量。上述反轉錄PCR按照大連寶生物反轉錄試劑盒的要求進行反轉錄。上述克隆和測序，包括PCR擴增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質粒的轉化、轉化菌落的PCR鑒定與培養、質粒的回收、質粒的酶切鑒定和重組質粒的測序。上述PCR擴增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進行。上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。 上述質粒的轉化為將感受態細胞加入到回收片段同T載體的連接產物中，冰浴 30分鐘，然后在42°C水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘，加液體LB培養基，37°C 復活50分鐘，后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上，37°C恒溫培養10-15小時。上述轉化菌落的PCR鑒定與培養為挑選轉化培養的單菌落，放入到加有PCR反應液的EP管中晃動，使單菌落充當模板；用獲得該片段的PCR條件進行擴增，PCR產物同 Marker (和樣品一起電泳的參照物，通過對比來確定樣品的大小)一起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的與之對應的單菌落，放入含有的青霉素鈉LB液體培養基中，37°C過夜搖菌培養，用于質粒回收。上述質粒的回收用上海華舜小量質粒抽提純化試劑盒實現。上述質粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定，選擇內切酶Bam H I和Hin d III。本專利技術在提供了雙峰馬它角蛋白基因的cDNA序列和蛋白編碼序列基礎上；將人、 鼠、牛等不同物種角蛋白基因的CDS序列和氨基酸序列進行同源性比較；對包括雙峰駝在內的9個物種的九個角蛋白基因的CDS序列構建了系統發生樹。本專利技術中的雙峰駝角蛋白基因的cDNA序列是通過以雙峰駝組織中總RNA為模板， 參考人、鼠、牛等物種的角蛋白基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝角蛋白基因cDNA序列見SEQ ID NO.1。將雙峰駝角蛋白基因cDNA序列中的編碼序列(OTS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質編碼序列見SEQ ID NO. 2。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR產物長度為1662bp,電泳結果見附圖1，其中49-51位為起始密碼子ATG，1444-1446位為終止密碼子TAA，49-1446位為編碼蛋白質區域(OTS)。 在SEQ ID NO. 1，雙峰駝角蛋白基因編碼465個氨基酸。雙峰駝與牛(ΝΡ_001179454)和豬(XP_003131480)的角蛋白核酸序列具有92 %的相似性。雙峰駝和人、鼠、牛等動物用 Clustal X中對齊的角蛋白基因編碼氨基酸序列同源性比較結果見附圖2。對包括SEQ ID NO.1在內的9個物種的九條角蛋白基因的⑶S序列構建了系統發生樹，結果發現雙峰駝角蛋白同牛和豬的進化距離最近，間接證明了所得到的序列確為雙峰馬它角蛋白基因。本專利技術所得到的角蛋白的基因序列和該蛋白結構的數據可用于研究其在絨毛纖維發育中的重要作用，為闡明雙峰駝絨毛形成機理和提高絨毛質量提供理論基礎和依據， 并能夠為其它哺乳動物的絨毛組分研究奠定一定的生物學基礎。附圖說明圖1為雙峰駝角蛋白基因RT-PCR產物電泳圖2為構建系統發生樹所用角蛋白氨基酸同源性比較；圖3為不同物種角蛋白氨基酸序列系統進化樹。具體實施方式下面實施例用于對本專利技術的進一步說明，但不用來限制本專利技術的保護范圍。實施例1:雙峰駝角蛋白基因cDNA序列的克隆1、組織分離(Isolation)從內蒙古阿拉善盟雙峰駝，快速采得本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種雙峰駝角蛋白，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示：(a)SEQ?ID?NO.2所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或／和疊加一個或多個氨基酸衍生得到的，且與(a)編碼蛋白質具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：烏仁套迪，陳國華，巴拉，
申請(專利權)人：烏仁套迪，
類型：發明
國別省市：