一種rTRAIL突變體及其海兔毒素偶聯物。本發明專利技術公開了一種rTRAIL突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發明專利技術還公開了所述rTRAIL突變體的編碼基因及含有該編碼基因的表達單元、重組載體或表達系統。本發明專利技術還公開了一種rTRAIL突變體-vcMMAE偶聯物及其制備方法和應用。本發明專利技術偶聯物具有rTRAIL突變體和MMAE兩者的生物學功能，通過rTRAIL突變體與腫瘤細胞表面的死亡受體特異結合，將MMAE定向轉運到腫瘤細胞，并在腫瘤細胞內釋放發揮作用，既可殺傷對TRAIL敏感性低甚至抵抗的腫瘤細胞，也減少MMAE單獨給藥產生的毒副作用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物技術和藥物領域，尤其涉及一種rTRAIL突變體及其海兔毒素偶聯物。
技術介紹
腫瘤壞死因子(TNF)相關的凋亡誘導配體(TNF relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL，或Apo2L，TNFSF10)是繼TNF、FasL之后發現的第三個TNF家族的凋亡因子，為一種抗癌應用前景良好的生物藥物。TRAIL由Wiley等從心肌cDNA文庫中克隆出來的，因其氨基酸序列具有TNF超家族的結構特征并能誘導Jurkat細胞和EB病毒轉化的人類淋巴細胞凋亡而得名。TRAIL屬II型跨膜蛋白，由281個氨基酸組成，其N端(f 17位氨基酸)位于胞內，C端(第39 281位氨基酸)延伸到胞外，其中第11Γ281位是發揮主要功能的部位。許多臨床前期研究表明TRAIL能有效誘導多種癌細胞系凋亡，但對正常細胞無毒副作用。目前國外已進行關于TRAIL及其受體激動型抗體的I、II期臨床試驗，并取得初步療效。另外，TRAIL對NF-K B僅有很微弱的激活作用，即使是全身用藥，也不會像TNF-α和Fas-L那樣產生嚴重的炎癥反應，這些特性使得TRAIL有成為新一代抗腫瘤藥物的潛質。TRAIL在免疫系統細胞中表達，包括NK細胞、T細胞、巨噬細胞和樹突細胞，并且位于細胞膜中，可經半胱氨酸蛋白酶加工成可溶形式。TRAIL是通過與與其細胞膜受體結合發揮誘導凋亡作用的。目前已發現5種TRAIL受體，包括TRAIL-R1 (DR4，TNFSFIOa)和TRAIL-R2 (DR5, TNFRSFIOb)；TRAIL-R3 (DcRl，TNFRSFlOc)和 TRAIL-R4 (DcR2, TNFRSFlOd)；循環骨保護素(OPG，TNFRSFllb)。DR4和DR5具有一段死亡結構域(DD)，是TRAIL結合受體后誘導凋亡所必需的。其余三個受體由于缺乏功能性死亡結構域，雖然能與TRAIL結合，但無法誘導凋亡。TRAIL與DR4或DR5結合后可激活線粒體依賴和非線粒體依賴兩條細胞凋亡信號途徑，介導死亡信號傳導入細胞內，啟動效應物半胱天冬酶-3 (caspase-3)，最終引起腫瘤細胞凋亡。近年來，人們發現重組可溶TRAIL誘導了廣譜的人腫瘤細胞系凋亡，但同時也存在一些對TRAIL敏感性較低或耐受的腫瘤細胞，如所有的人黑色素瘤細胞系、大部分乳腺癌細胞系、前列腺癌細胞系LNcaP等，這些細胞表面雖然或多或少也表達DR4或DR5，卻由于細胞內凋亡途徑中關鍵酶的缺失、突變和其他抑制凋亡的蛋白高表達等原因，導致TRAIL結合DR4或DR5之后并不能引起細胞的最終凋亡。對于這類細胞所形成的實體瘤，亟須其他治療手段或改造TRAIL使之具備殺傷敏感性低以及耐受腫瘤細胞的能力。研究發現，可溶型重組TRAIL (rTRAIL)與放化療聯合應用能提高腫瘤細胞對rTRAIL的敏感性，二者具有協同作用。目前國際通用的rTRAIL是95^281位氨基酸片段，rTRAIL單體傾向于形成生物活性較好的三聚體而存在，在三聚體的頂部有一個鋅離子結合位點，對穩定三聚體構象起重要作用。但聯合治療方案僅是將rTRAIL和這些藥物同時給藥，并未在二者之間建立聯系，無法將這些藥物單一地導向腫瘤細胞，因此一般只選擇低劑量低毒性的藥物，以免對正常細胞產生毒害。相應地，也就無法得到更好的治療效果。因此，若能將一些能夠強力殺傷腫瘤細胞的藥物加以有效利用，將更有利于腫瘤的治療。例如化療藥物海兔毒素(MonomethylauristatinE, MMAE)是一種人工合成抗腫瘤小分子,它通過抑制細胞內微管蛋白二聚化而誘導細胞凋亡。但由于它具有很強的無選擇毒性，會對正常細胞造成傷害，所以其本身并不能成藥。另外，針對TRAIL的突變體、TRAIL受體的抗體的研究都在進行中，但治療效果仍不理想。
技術實現思路
本專利技術提供了一種rTRAIL突變體，將特定氨基酸突變為半胱氨酸，從而實現與海兔毒素的偶聯，且不會大幅降低蛋白對腫瘤細胞的殺傷力。一種rTRAIL突變體，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。·該突變體取自全長TRAIL蛋白的第95 281個氨基酸，且第109位的天冬酰胺(Asn)突變為半胱氨酸(Cys)。本專利技術還提供了一種編碼所述rTRAIL突變體的基因，堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。該基因第109位編碼天冬酰胺(Asn)的密碼子AAT突變為編碼半胱氨酸(Cys)的密碼子 TGT。本專利技術還提供了一種含有所述基因的表達單元、重組載體或表達系統。所述表達單元的啟動子為T7，在這些啟動子的作用下，rTRAIL突變體可以直接在大腸桿菌宿主細胞中實現胞內可溶表達。所述重組載體的原始載體為pET_28a ( + )。所述表達系統可選細菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞表達系統，優選為細菌表達系統，最優選為大腸桿菌表達系統。本專利技術還提供了一種rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯物，由海兔毒素通過連接臂偶聯rTRAIL突變體三聚體構成。所述海兔毒素的合成方法參考美國專利文獻Tumerinhibiting tetrapeptide bearing modified phenethylamides,(專利號5,635, 483)。本專利技術所使用的連接臂為馬來酰亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽，其合成方法參考文獻Gene M. D. , et al, Cathepsin B-Labile Dipeptide LinkersforLysosomal Release of Doxorubicin from Internalizing Immunoconjugates:ModelStudies of Enzymatic Drug Release and Antigen-Specific In VitroAnticancerActivity,Bioconjugate Chem.，13(4)855-869(2002).。本專利技術帶連接臂的海兔毒素(vcMMAE)由江陰康諾泰生物技術有限公司代為合成，也可以參考文獻(Svetlana 0. D. , et al, Development of potentmonoclonal antibodyauristatin conjugates for cancer therapy, NatureBiotechnology. , 21 (7) 778-784(2003).),偶聯時再通過纈氨酸上的馬來酰亞胺與rTRAIL突變體的半胱氨酸巰基進行烷基化反應，最終形成本專利技術偶聯物。本專利技術還提供了所述rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯物的制備方法，包括(I)將rTRAIL突變體多聚體解聚，重新聚合得到rTRAIL突變體三聚體，具體包括將rTRAIL突變體溶于含鋅離子的緩沖液中，加入磷酸三(β -氯乙基)酯，3(T40°C水浴反應I 3h ；由于rTRAIL突變體之間會通過二硫鍵形成多聚體，加入磷酸三(β-氯乙基)酯(TCEP)使不穩定的多聚體解聚，保持單體狀態，反應體系中的鋅離子進一步促使rTRAIL突變體單體形成穩定的三聚體。(2)將rTRAIL突變體三聚體與帶連接臂的海兔毒素混合，進行偶聯反應，偶聯后，每個三聚體可以結合1-3個海兔毒素分子；偶聯本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種rTRAIL突變體，其特征在于，氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳樞青，潘利強，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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