本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種通式(I)的維生素B2的偶聯(lián)物,由維生素B2半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。其中n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的維生素B2的分子數(shù),所述n為整數(shù)1～20，BSA為牛血清蛋白,分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了所述的偶聯(lián)物的制備方法,即將維生素B2與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物。本發(fā)明專利技術(shù)的維生素B2的偶聯(lián)物通過免疫新西蘭大白兔,制備了效價(jià)達(dá)1∶256,000的抗血清,其最低檢測限為1.07ng/ml。本發(fā)明專利技術(shù)具有方法簡便,快速,特異,準(zhǔn)確的特點(diǎn),為制備維生素B2的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒提供了基礎(chǔ)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種維生素B族維生素，尤其涉及一種 維生素&。屬于營養(yǎng)素免疫檢測領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
本專利技術(shù)涉及的下列名稱適用于整個(gè)說明書和權(quán)利要求書： BSA:血清蛋白（BovineSerumAlbumin)，Sigma公司產(chǎn)品 PBS:磷酸緩沖液（PhosphateBufferedSaline)(0.01M，pH=7.40) Sephadex_G75 :葡聚糖凝膠，Sigma公司產(chǎn)品cBSA:經(jīng)乙二胺修飾的牛血清蛋白 透析膜：索萊寶科技有限公司 維生素B2:Sigma公司產(chǎn)品 ⑶I:N，N' -羰基二咪唑，Sigma公司產(chǎn)品 DMAP:4_二甲氨基P比啶，Sigma公司產(chǎn)品。 維生素B2，又名核黃素，早在1879年就被英國化學(xué)家布魯斯于牛奶中發(fā)現(xiàn)，它是黃 素輔酶的重要組成部分，主要參與細(xì)胞呼吸鏈的氫傳遞過程。飲食中缺乏維生素B2可能造 成皮膚及粘膜炎癥、貧血、以及畏光等癥狀。最近有報(bào)道指出，維生素B2還參與核酸修復(fù)過 程以及細(xì)胞凋亡過程。由于維生素B2無法由人體自身合成，并且無法在體內(nèi)蓄積，因此只 能從日常飲食中攝取維生素B2。含維生素^較多的食物有動(dòng)物肝臟、蛋黃、牛奶、鱔魚等。 維生素B2的日常建議攝入量為男士1.3mg/天，女士I.Img/天。在兒童發(fā)育期、婦女哺 乳期、創(chuàng)傷、患有慢性消耗性疾病時(shí)，由于機(jī)體需求量增大，日常飲食攝入可能無法滿足機(jī) 體需要，可能會造成維生素B2缺乏癥，此時(shí)需適當(dāng)補(bǔ)充維生素B2。美國和加拿大人口的日 平均攝入量為男性2mg/天，女性1.5mg/天。95%的美國人口每天從食物和保健品中攝 入的維生素B2為4-10mg/天。雖然人體排泄維生素B2的能力較強(qiáng)，但大量攝入維生素B2 仍有可能對腎功能產(chǎn)生影響。而維生素B2在中國的平均攝入量只有0.9mg/天，低于推薦 的標(biāo)準(zhǔn)。因此，在兒童成長過程中檢測維生素&是十分必要的。 微生物法是維生素檢測中歷史久遠(yuǎn)的經(jīng)典分析手段，它利用某類微生物對特定營 養(yǎng)物質(zhì)的特殊依賴作用進(jìn)行檢測。現(xiàn)今的許多標(biāo)準(zhǔn)中，仍將微生物法作為維生素檢測的 首選方法，如AOAC(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)、AACC(American AssociationofCerealChemists)等。但是，由于檢測原理的特點(diǎn)，微生物法有著自身的 局限與不足。首先，微生物法較其他分析方法耗時(shí)更長。由于分析結(jié)果由相應(yīng)微生物的生 長程度來指征，因此需預(yù)留微生物生長的足夠時(shí)間，檢測一般需要4到6天。第二，微生物 法由于涉及微生物培養(yǎng)，對操作環(huán)境有一定的要求。第三，步驟繁瑣，即便是商品化的微生 物法試劑盒，在使用時(shí)也要進(jìn)行嚴(yán)格的樣品前處理、培養(yǎng)基配置、結(jié)果處理等等。因此，微生 物法已漸漸被其他分析方法所取代。儀器分析方法如高效液相色譜法是應(yīng)用廣泛的方法。 這些方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法。但儀器法價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)較長，且造成有機(jī) 溶劑污染，需要大型儀器設(shè)備，需要專門的技術(shù)人員。酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA)提供了一種 極好的檢測手段。該法具有快速，準(zhǔn)確，簡易，不需要專門人員操作等優(yōu)點(diǎn)，這使得ELISA法 成為一種理想的，可用于常規(guī)檢測方法。酶聯(lián)免疫檢測法的核心是需要高質(zhì)量的抗體。大 部分維生素都是小分子有機(jī)化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以，必須把這些化 合物轉(zhuǎn)變?yōu)槟芤l(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。經(jīng)檢索，目前世 界上尚未有維生素B2的免疫原的合成及抗體制備的報(bào)道，因此研究維生素B2的免疫原的合 成及抗體制備就顯得十分必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)要解決的問題是：提供一種能引發(fā)動(dòng)物免疫系 統(tǒng)產(chǎn)生針對維生素B2有特異反應(yīng)的抗體的免疫原，即維生素B2的偶聯(lián)物及其制備方法。同 時(shí)，本專利技術(shù)還提供了所述的維生素B2的偶聯(lián)物作為免疫原在制備維生素1特異反應(yīng)抗體中 應(yīng)用。 本專利技術(shù)的維生素82的偶聯(lián)物，由維生素B2半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)牛血清 蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。 其中：上述產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)優(yōu)選是牛血清蛋白。 本專利技術(shù)所述的維生素82的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如（I)(I) 其中m為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的維生素B2的分子個(gè)數(shù)，所述n為整數(shù)1~20，BSA為牛血清蛋白（Bovineserumalbumin)，分子量范圍 6. 6KDa~6.9Kda; 上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征： (1) 外觀：白色粉末固體； (2) 紫外吸收光譜：373nm，445nm 上述的維生素82的偶聯(lián)物，其特征是：所述n為整數(shù)5~15,BSA分子量范圍 6. 6KDa~6. 9Kda 上述的維生素B2的偶聯(lián)物的制備方法是：將維生素B2與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接 起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。 上述的維生素B2的偶聯(lián)物的制備方法，由如下步驟完成： (1) 溶液A的制備：將維生素B2,N，N'_羰基二咪唑（⑶1)，4_二甲氨基吡啶（DMP)以 摩爾比1:2~8:0. 2 ~1溶解于二甲基甲酰胺中，反應(yīng)生成維生素82與N，N' -羰基二咪唑的 活性中間體，備用； (2) cBSA的制備：在0~4°C條件下，先將乙二胺溶于pH為7. 38~7. 56,濃度為 0. 01M~0. 02M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7. 38~7. 56;以乙二胺：BSA:EDC的摩爾 比為15~25: 1: 15~25的量稱取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20±5°C條件下攪 拌反應(yīng)2~4小時(shí)；將乙二胺與BSA的反應(yīng)溶液在0~4°C條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析 70~80小時(shí)，然后改用蒸餾水透析20~30小時(shí)，每6小時(shí)更換一次透析液；在0~4°C，以13000 轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA， 備用； (3) 溶液B的配置：把cBSA溶于pH為7. 38~7. 56,濃度為0? 01M~0. 02M磷酸緩沖溶液 中，配成10. 〇±5. 0mg/ml的溶液，備用； (4) 按維生素82與cBSA的摩爾比為15~50:1量分別取溶液A和溶液B，在20°C±5°C 溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應(yīng)4~6小時(shí)，得到溶液C; (5) 溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析70~80小時(shí)，再改用蒸餾水透析20~30小時(shí)，每 6小時(shí)更換一次透析液；然后在0~4°C下，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分 鐘，取上清液； (6) 凍干上清液，得到白色維生素B2的偶聯(lián)物。 在上述的維生素&的偶聯(lián)物的制備方法中：步驟（1)所述的維生素B2，N，N' -羰基 二咪唑（⑶I)，4-二甲氨基吡啶（DMP)的摩爾比優(yōu)選為1:5:1。 在上述的維生素&的偶聯(lián)物的制備方法中：步驟（2)所述乙二胺與牛血清蛋白、 EDC的摩爾比為20:1:20。 在上述的維生素82的偶聯(lián)物的制備方法中：步驟（2) (3)所述的磷酸緩沖液pH優(yōu) 選為7. 40,濃度優(yōu)選為0. 01M。 在上述的維生素82的偶聯(lián)物的制備方法中：步驟（4)所述維生素B2與牛血清蛋白 的摩爾比為3本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種維生素B2的偶聯(lián)物,由維生素B2半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：郗日沫，李小剛，孟萌，尹永梅，張麗沙，董亞慶，宋兆瑞，王玉芬，許坤，龍浩，
申請(專利權(quán))人：天津三箭生物技術(shù)有限公司，南開大學(xué)，李小剛，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12
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