本發明專利技術涉及一株太空環境下肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株的生物學特性、基因組DNA序列、轉錄組和差異蛋白組學，特別是同地面肺炎克雷伯氏菌比較分析鑒定出的功能序列和分子在闡明空間環境對微生物的作用及用途，可獲得全面、準確的空間誘變肺炎克雷伯氏菌菌株突變的基因、差異表達基因和蛋白質。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
；更具體地，本專利技術涉及太空環境下肺炎克雷伯氏菌的生物學特性、全基因組測序信息、轉錄組測序以及差異蛋白組學分析。
技術介紹
在航天過程中的人體多個器官生理功能都會受到影響，空間駐留人員的免疫系統功能下降，更容易受到病原菌的感染；此外，細菌在太空環境中的毒力和致病性可能會發生改變，對外界環境抵抗力增強以及對抗生素 的敏感性下降。因此，了解空間環境對細菌特別是機會致病菌的影響，并在此基礎上制定有效的防護措施，對保障空間駐留人員的健康是非常重要的。同時，空間環境下細菌改變的特征相關成果可應用于地面。肺炎克雷伯菌，又稱肺炎桿菌，是一種廣泛分布于自然界的最常見革蘭陰性菌之一，為人體的正常菌群。在接受侵入性診療或者免疫功能低下的患者中常可導致呼吸道感染、尿路感染、腹腔感染、敗血癥、化膿性腦膜炎、皮膚軟組織感染和傷口感染等，是腸桿菌科克雷伯菌屬中對人致病性較強的重要機會性致病菌和醫源性感染菌。近年來隨著臨床上廣譜抗菌藥物的大量應用，其檢出率和耐藥率呈上升趨勢。基于生物信息學的基因組、轉錄組、蛋白組等組學的研究越來越多，是揭示各種生命現象發生分子機理的較好切入點。通過組學的方法研究空間環境對肺炎克雷伯氏菌的作用，為研究天空環境下細菌變異機理奠定了基礎，有利于開展空間的生物安全評估，同時為地面上難治性感染的研究提供新的思路。
技術實現思路
本專利技術的一個目的提供空間環境誘變的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株本專利技術提供的該菌株，其保藏號為CG MCC NO. 6520。—株肺炎克雷伯氏菌，其特征包括革蘭氏染色陰性，呈單個、短桿狀；同地面對照株的抗生素耐受性相比，對復方新諾明更耐受；無生長速度的差異；不能利用N-乙酰神經氨酸和D-甘露醇進行代謝，而對照組可以利用。所述的肺炎克雷伯氏菌，利用全基因組測序和比較基因組學分析獲得基因突變，見表1，空間環境導致LCT-KP289基因組上SNP的變化，包括SNP在基因組上的位置，突變位點及編碼蛋白以及注釋出的基因。表1:空間環境導致LCT-KP289基因組上SNP的變化SNP位置突變堿基參考基因ID注釋庫ID突變蛋白scaffold 1_548898C-AUUWGL000650gi|152973077 G-Gscaffold4_916275G^TUUWGL001928gi|238896298 G —Vscaffold8jl119951G-TUUWGL004713tr|C4X7G8P-Qscaffold8_1119952G-AUUWGL004713tr|C4X7G8P —Sscaffold9_841241G-TUUWGL005614tr|G0GS85G-Vscaffold9_913353C —AUUWGL005686tr|G0GT30P —Tscaffold 9_913358C-AUUWGL005686tr|G0GT30S-S所述的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株，進行轉錄組測序鑒定差異表達基因(FDR ( O. 001 和 I log2Ratio| 彡 2)見附表 I。所述的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株，進行差異蛋白組學分析鑒定的差異表達蛋白(蛋白豐度差異倍數超過2倍以上時；經統計檢驗其p-value值小于O. 05 ;三次重復中至少兩次重復中達到上述要求)見附表2。附圖說明圖1肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株革蘭氏染色圖2肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株生理生化鑒定圖3肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株生長曲線圖4肺炎克雷伯氏菌LCT-KP214菌株生長曲線圖5LCT-KP289菌株的GC含量與Depth關聯分析6LCT-KP289菌株和地面對照組LCT-KP214的二維共線性7LCT-KP289菌株的轉錄組測序基因覆蓋度8轉錄組測序鑒定的差異表達基因圖9差異蛋白組學鑒定的差異表達蛋白質附件說明附件1LCT-KP289菌株轉錄組測序分析的差異表達基因信息附件2LCT-KP289菌株定量蛋白組學分析的差異表達蛋白信息具體實施例方式下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施實例一肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株的革蘭氏染色取50ul樣品離心，棄上清，加入無菌水50ul，吸取20ul于載玻片上進行固定；初染，吸取革蘭氏染色I (結晶紫)2滴于載玻片樣品上進行初染lmin，然后用自來水沖洗染液；媒染，吸取革蘭氏染色II (碘液)2滴覆蓋涂面染約lmin，然后用自來水沖洗染液，用吸水紙吸取涂面上的水分；脫色，吸取革蘭氏染色III (酒精)2滴滴在涂面上約30s，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分；復染，吸取革蘭氏染色IV(番紅)2滴滴在涂 面上約lmin，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分；觀察，先用顯微鏡低倍鏡找到目標視野，然后再用油鏡(100X)進行觀察，判定并記錄結果、拍照，見圖1，從圖中可看出LCT-KP289菌株革蘭氏染色陰性，呈單個、短桿狀形態。實施實例二 肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株的抗生素敏感性檢測配制LB固體培養基25L，滅完菌后倒1500個平板，晾干，備用；菌懸液的制備，取出這些單菌的斜面，并準備盛有Iml無菌生理鹽水的1. 5ml離心管，用滅菌的竹簽從斜面上蘸取適量菌種于1. 5ml離心管中，混勻，調菌濃度約107 108 ;稀釋涂布，吸取備好的菌懸液IOOul進行涂布，盡可能地涂布均勻，每株單菌涂6個平板，每涂完一株菌，就進行下一步(粘貼藥敏片)；粘貼藥敏片，選擇抗生素進行藥敏試驗，以篩選出抗藥性突變的菌 株；貼完藥敏片后，將平板放置在37°C下培養18 24h ;觀察結果，將平板培養18 24h，取出觀察平板上藥敏片的抑菌情況，并記錄抑菌圈的大小(直徑cm)，其中藥敏片直徑約為0. 6cm。肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289同地面對照LCT-KP214菌株相比，對復方新諾明更耐受，LCT-KP289無抑菌圈的形成，而LCT-KP214菌株抑菌圈達到1. 8cm。實施實例三肺炎克雷伯氏菌LCT-KP289菌株的生理生化鑒定實驗菌懸液制備，取出菌株的斜面，用滅菌竹簽蘸取菌種接種在LB液體培養基中(4ml體系)，培養24h。然后取2ml菌液6000r/s離心5min，棄上清培養基，留下離心的菌體，然后用滅菌的生理鹽水洗滌菌體，6000r/s離心5min，再次棄去上清，再用Biolog接種液進行懸浮菌體，最后再轉至15ml的接種液中。調至濃度約IO7 IO8 ;接種，將以上菌懸液倒至接種皿中，震蕩均勻，用12道(或8道)排槍進行加樣，每個Biolog板孔加樣IOOul，共96孔，加完樣后，蓋上Biolog板蓋,放置在37°C下培養，24h和48h進行觀察，并記錄結果,見圖2和表2，可看出LCT-KP289菌株不能利用N-乙酰神經氨酸和D-甘露醇進行代謝。表2 LCT-KP289菌株的生理生化鑒定結果編號I底物|LCT-KP289菌株 I地面對照菌株— A4 _D-海藻糖+/-+ B9 N-乙酰神經氨酸-^+D2 _D-甘露醇-+D4 肌醇-'1-+— F7 ■半乳糖二酸+F9_ D-葡糖二酸_+_+A_ G6~本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種肺炎克雷伯氏菌LCT?KP289，其保藏號為：CGMCC?NO.6520。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉長庭，郭英華，方向群，王俊峰，李天志，常德，蘇龍翔，王雅娟，陳振鴻，王立，
申請(專利權)人：中國人民解放軍總醫院，
類型：發明
國別省市：
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