一株空間肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株制造技術

本發明專利技術涉及一株太空環境下肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的生物學特性、基因組DNA序列、轉錄組和差異蛋白組學，特別是同地面肺炎克雷伯氏菌比較分析鑒定出的功能序列和分子在闡明空間環境對微生物的作用及用途，可獲得全面、準確的空間誘變肺炎克雷伯氏菌菌株突變的基因、差異表達基因和蛋白質。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
；更具體地，本專利技術涉及太空環境下肺炎克雷伯氏菌的生物學特性、全基因組測序信息、轉錄組測序以及差異蛋白組學分析。
技術介紹
隨著人類不斷進行太空探索，太空成為人類活動的新領域，而空間環境十分復雜，如微重力、宇宙輻射、極端溫度等，這些因素對空間駐留人員體內及空間站中的細菌生物學性狀及致病性都會產生影響，在空間站中已檢測出肺炎克雷伯氏菌等多種細菌，空間環境對微生物的作用和機制研究是迫切需要關注的前沿問題。克雷伯氏菌是革蘭氏陰性桿菌，是一種無動力菌，屬于腸桿菌屬兼性厭氧菌，包括鼻硬結亞種、鼻炎亞種和肺炎亞種等三個亞種。其中克雷伯氏菌鼻硬結亞種，主要侵犯鼻咽·部，常導致慢性肉芽腫性病變，故又稱鼻硬結桿菌；臭鼻亞種，主要引起慢性萎縮性鼻炎，有惡臭，因此被稱為又稱臭鼻桿菌；肺炎亞種，即肺炎桿菌，常存在于人體上呼吸道和腸道中。肺炎克雷伯氏菌是一種無處不在的條件致病菌，寄生在人類的粘膜表面，對人致病性較強，并導致嚴重的疾病，如敗血癥，肺炎，尿路感染，軟組織感染。近年來隨著臨床上廣譜抗菌藥物的大量應用，其檢出率和耐藥率呈上升趨勢。隨著科學技術的不斷發展，近年來的基因組、轉錄組、蛋白組等組學的研究越來越多，也是揭示各種生命現象和病理生理過程發生的分子機理的較好切入點。通過基因組、轉錄組測序和蛋白組等方法系統地分析太空環境導致細菌發生變化的機理，研究空間環境對肺炎克雷伯氏菌的作用和機理，有利于了解天空環境下細菌致病性發生變化的機理，以及通過研究空間環境下細菌發生的改變，為地面上難治性感染的研究提供新的啟示。
技術實現思路
本專利技術的一個目的提供空間環境誘變的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株本專利技術提供的該菌株，其保藏號為CGMCC NO. 6521。—株肺炎克雷伯氏菌，其特征包括革蘭氏染色陰性，呈單個、短桿狀；同地面對照株的抗生素耐受性相比，無明顯變化；無生長速度的差異；Biolog反應板上醋竹桃霉素(_)、二甲胺四環素(_)、潔霉素(_)、鹽酸胍(_)、硫酸四癸鈉(_)、萬古霉素(_)、四唑紫(_)、四唑藍(_)、梭鏈孢酸(_)。所述的肺炎克雷伯氏菌，利用全基因組測序和比較基因組學分析獲得基因突變，見表1，空間環境導致LCT-KP182基因組上SNP的變化，包括SNP在基因組上的位置，突變位點及編碼蛋白以及注釋出的基因。表1:空間環境導致LCT-KP182基因組上SNP的變化SNP位置突變堿基參考基因ID 注釋庫ID突變蛋白scaffold 1_548898C-AUUWGL000650gi|152973077G-Gscaffold4_916275G-TUUWGL001928gi|238896298G-Vscaffold8_1119951G —TUUWGL004713 tr|C4X7G8P-Qscaffold8_1119952G —AUUWGL004713 tr|C4X7G8P^Sscaffold9_841241G-TUUWGL005614 tr|G0GS85G-V scaffold9_913353C-AUUWGL005686 tr|G0GT30P-Tscaffold9_913358C —AUUWGL005686 tr|G0GT30S —S所述的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株，進行轉錄組測序鑒定差異表達基因(FDR ( 0. 001 和 I log2Ratio| 彡 2)見附表 I。所述的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株，進行差異蛋白組學分析鑒定的差異表達蛋白(蛋白豐度差異倍數超過2倍以上時；經統計檢驗其p-val ue值小于0.05;三次重復中至少兩次重復中達到上述要求)見附表2。附圖說明圖1肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株革蘭氏染色圖2肺炎克雷伯氏菌LCT-KP18 2菌株生理生化鑒定圖3肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株生長曲線圖4肺炎克雷伯氏菌LCT-KP214菌株生長曲線圖5肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株溶血情況圖6LCT-KP182菌株的GC含量與Depth關聯分析7LCT-KP182菌株和地面對照組LCT-KP214的二維共線性8LCT-KP182菌株的轉錄組測序基因覆蓋度9轉錄組測序鑒定的差異表達基因圖10差異蛋白組學鑒定的差異表達蛋白質附件說明附件1LCT-KP182菌株轉錄組測序分析的差異表達基因信息附件2LCT-KP182菌株定量蛋白組學分析的差異表達蛋白信息具體實施例方式下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施實例一肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的革蘭氏染色取50ul樣品離心，棄上清，加入無菌水50ul，吸取20ul于載玻片上進行固定；初染，吸取革蘭氏染色I (結晶紫)2滴于載玻片樣品上進行初染lmin，然后用自來水沖洗染液；媒染，吸取革蘭氏染色II (碘液)2滴覆蓋涂面染約lmin，然后用自來水沖洗染液，用吸水紙吸取涂面上的水分；脫色，吸取革蘭氏染色III (酒精)2滴滴在涂面上約30s，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分；復染，吸取革蘭氏染色IV(番紅)2滴滴在涂面上約lmin，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分；觀察，先用顯微鏡低倍鏡找到目標視野，然后再用油鏡(IOOX)進行觀察，判定并記錄結果、拍照，見圖1，從圖中可看出LCT-KP182菌株革蘭氏染色陰性，呈單個、短桿狀。實施實例二 肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的抗生素敏感性檢測配制LB固體培養基25L，滅完菌后倒1500個平板，晾干，備用；菌懸液的制備，取出這些單菌的斜面，并準備盛有Iml無菌生理鹽水的1. 5ml離心管，用滅菌的竹簽從斜面上蘸取適量菌種于1. 5ml離心管中，混勻，調菌濃度約107 108 ;稀釋涂布，吸取備好的菌懸液100 μ I進行涂布，盡可能地涂布均勻，每株單菌涂6個平板，每涂完一株菌，就進行下一步(粘貼藥敏片)；粘貼藥敏片，選擇抗生素進行藥敏試驗，以篩選出抗藥性突變的菌株；貼完藥敏片后，將平板放置在37°C下培養18 24h ;觀察結果，將平板培養18 24h，取出觀察平板上藥敏片的抑菌情況，并記錄抑菌圈的大小(直徑cm)，其中藥敏片直徑約為O. 6cm。肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182同地面對照LCT-KP214菌株相比，其抑菌圈無明顯變化。實施實例三肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的生理生化鑒定實驗菌懸液制備，取出菌株的斜面，用滅菌竹簽蘸取菌種接種在LB液體培養基中(4ml體系)，培養24h。然后取2ml菌液6000r/s離心5min，棄上清培養基，留下離心的菌體，然后用滅菌的生理鹽水洗滌菌體，6000r/s離心5min，再次棄去上清，再用Biolog接種液進行懸浮菌體，最后再轉至15ml的接種液中。調至濃度約IO7 IO8 ;接種，將以上菌懸液倒至接種皿中，震蕩均勻，用12道(或8道)排槍進行加樣，每個Biolog板孔加樣IOOul，共96孔，加完樣后，蓋上Biolog板蓋,放置在37°C下培養，24h和48h進行觀察，并記錄結果,見圖2和表2，可看出醋竹桃霉素(_)、二甲胺四環素(_)、潔霉素(_)、鹽酸胍(_)、硫酸四癸鈉(_)、萬古本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種肺炎克雷伯氏菌LCT?KP182，其保藏號為：CGMCC?NO.6521。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉長庭，郭英華，方向群，王俊峰，李天志，常德，蘇龍翔，王雅娟，陳振鴻，郭娜，
申請(專利權)人：中國人民解放軍總醫院，
類型：發明
國別省市：