本發(fā)明專利技術公開了一株耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)Y10及其在防治犬腸炎、腹瀉病方面的應用。該菌株通過分離、篩選和鑒定而獲得，保藏編號為：CCTCC?NO：M2011134；該地衣芽孢桿菌Y10可制成微生態(tài)制劑，作為獸藥和犬食品添加劑使用，調整腸道菌群失調，提高犬腸道微生物多樣性及免疫器官指數，改善犬生長性能，有效防治犬腹瀉病，為預防犬腸道細菌性疾病提供新的思路，同時也為犬源微生態(tài)制劑的發(fā)展提供可行的備用菌種。本發(fā)明專利技術適用于飼料廠和規(guī)模化養(yǎng)犬場。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及一株經分離而獲得的耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好且能較顯著改善犬腸道環(huán)境，促進微生態(tài)平衡從而降低腹瀉率的地衣芽孢桿菌(BaciIluslicheniformi) Yltl及其在防治犬腹瀉病方面的應用，屬于預防獸醫(yī)
技術介紹
自上世紀八十年代以來，微生態(tài)制劑作為生物獸藥和飼料添加劑已廣泛用于仔豬、犢牛、羔羊、家禽等動物腸炎、腹瀉病的預防和治療上。目前專門用于寵物犬的國產微生態(tài)制劑還沒有問世，臨床上常使用人用微生態(tài)制劑如整腸生、益菌生等來調節(jié)犬的腸道菌群平衡，但效果并不理想。國外已出現(xiàn)了犬用微生態(tài)產品，但由于目前微生態(tài)制劑作為食品添加劑的相關標準尚不完善，生產質量控制薄弱，一些產品達不到包裝上所標示的活菌數 量，有的產品根本就不含有活菌(任普軍.2006.新獸醫(yī)，6 :48-50)，從而導致產品達不到治病、防病的作用，寵物用微生態(tài)制劑整體質量水平比較低，完全不能滿足寵物市場快速發(fā)展的需要。從2006年I月開始，歐盟已全面禁止在動物飼料中添加抗生素(劉興海.2007.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，5 :35-36)。隨著抗生素在我國的限用，甚至禁用，該病在我國養(yǎng)犬業(yè)中將越來越嚴重。因此，開發(fā)犬用微生態(tài)制劑，不僅對生態(tài)養(yǎng)犬和環(huán)境治理有重要意義，而且給生物獸藥業(yè)和飼料工業(yè)帶來巨大的經濟效益。目前許多國外學者對乳酸桿菌應用于犬的研究較多，而對芽孢桿菌應用于犬的研究不足(劉昆.2008.飼料工業(yè)，15 54-55)。益生菌(又叫微生態(tài)制劑，或微生物制劑，或微生物飼料添加劑)是最先被提出的抗生素替代品，它的作用主要在于扶植正常微生物菌群，調節(jié)生態(tài)平衡(李長強.2010.江西飼料，2 21-24)。迄今為止尚未見到有關地衣芽孢桿菌Yltl的篩選及其在防治犬腹瀉病中的應用的報道。
技術實現(xiàn)思路
針對目前抗生素的濫用及禁用導致疾病很難治愈的情況以及犬感染細菌導致腹瀉病后難以治愈或無法治療等問題，本專利技術的目的是提供一株具有耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好的地衣芽孢桿菌Yltl;同時也提供該地衣芽孢桿菌Yltl在獸藥或飼料中的應用，可用以預防和治療犬腹瀉病并調整犬腸道微生態(tài)平衡，提高腸道微生物多樣性。本專利技術參考益生菌可用于臨床上預防和治療動物疾病的思維，從健康犬糞樣中篩選出耐酸、耐膽鹽，抑菌效果好的地衣芽孢桿菌Yltl及菌劑，然后利用該菌劑在獸藥或犬日糧中的應用，證明添加本專利技術菌劑Yltl后，可以預防和治療犬腹瀉病；同時發(fā)現(xiàn)菌劑Yltl的應用能顯著提高犬腸道微生物的多樣性，調整犬腸道微生態(tài)平衡，改善犬生長性能。具體講，本專利技術解決其技術問題所采用的技術方案是本專利技術獲得具有耐酸、耐膽鹽，抑菌效果好的地衣芽孢桿菌Yltl的方法是(見圖1)采集健康犬糞樣，用蒸餾水稀釋后，用不同篩選培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)和鑒定，得到一株對葡萄球菌、大腸桿菌CVCC2060、綠膿桿菌、大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌339有顯著抑制作用的菌株Yltl，然后進行耐酸、耐膽鹽試驗。通過PCR擴增出菌株112的163 rDNA片段，經測序獲得目的基因序列。用美國生物信息學中心(NCBI)的BLAST程序對所初步獲得的菌株H2 的 16S rDNA 序列進行登錄，獲得登錄號為 FJ549021 (GenBank(Http://www. ncb1. nlm.nih. gov/blast/),與已收錄的序列進行核苷酸同源性比較。經過微生物學分類鑒定,確定該分離的菌株Ylt!為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) Yltl,該菌株已于2011年4月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為:CCTCC NO M2011134o本專利技術地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformi)Yltl(以下簡稱為“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”或“地衣芽孢桿菌Y1(l”)按照常規(guī)甘油冷凍方法保藏。本專利技術也提供本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”在獸藥或飼料中的應用。采用農業(yè)微生物常規(guī)操作方法將本專利技術制備成含“地衣芽孢桿菌CCTCC2011134”活菌含量不低于1.0X109cfu/g范圍的微生物制劑(以下簡稱“菌劑”)，以不低于0. 1%比例添加在犬日糧中，使其在犬日糧中活菌含量不低于1. OX 106cfu/g，可以預防和治療犬腹瀉病，促進其腸道內正常生理性厭氧菌的生長，調整腸道菌群失調，恢復腸道功能，提高犬腸道 微生物多樣性，增強機體免疫器官指數，改善犬的生長性能。本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC2011134”菌劑還可參照北京順達四海生物藥業(yè)有限公司公開的專利技術專利(公開號為CN102120972A，專利技術名稱地衣芽孢桿菌菌粉及微生態(tài)制劑的制備方法)所介紹的方法生產，應用后同樣能獲得相同效果。本專利技術具有以下效果(I)本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”具有耐酸、耐膽鹽，抑菌效果好，可用于治療由大腸桿菌、沙門氏菌等引起的犬腹瀉病并提高犬腸道微生物多樣性。(2)本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”可直接在獸藥或飼料中應用；也可制成微生態(tài)制劑，作為生物獸藥和犬食品添加劑使用，比如添加于犬日糧中使用，可有效預防和治療由大腸桿菌、沙門氏菌等引起的腹瀉病，促進其腸道內正常生理性厭氧菌的生長，調整腸道菌群失調，恢復腸道功能，提高犬腸道微生物多樣性及免疫器官指數，改善犬生長性能。這會給生物獸藥業(yè)和飼料工業(yè)帶來良好的經濟效益。本專利技術適用于飼料廠和規(guī)模化養(yǎng)犬場。附圖說明圖1為本專利技術的技術流程圖。圖2為本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”的抑菌試驗結果圖，其中A，B，C，D，E分別為本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對大腸桿菌CVCC2060、ATCC25922，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌和沙門氏菌抑菌效果。圖3為本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”總DNA的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。圖4為本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134” 16S rRNAPCR產物的1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。圖5為從Genbank里搜索出芽孢桿菌屬內12個不同種的16S rRNA序列建立芽孢桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹圖。圖6為本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”治療感染腹瀉病幼犬糞樣細菌總DNA的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖。該圖中，Marker為入-1lldigest，樣品在23kb處都有條帶。圖7為本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”治療感染腹瀉病犬糞樣細菌16SrRNA V3區(qū)PCR擴增結果。該圖中，Marker為D2000，PCR擴增得到200bp左右的16S rRNAV3區(qū)片段。圖8-圖9為本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對各組幼犬處理0日糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類分析圖。圖10-圖11為本專利技術“地衣 芽孢桿菌CCTCC 2011134”對各組幼犬處理9日糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類分析圖。圖12-圖13為本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對試驗組3幼犬糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類分析圖。圖14-圖15為本專利技術“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對試驗組4幼犬糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)Y10，其特征在于該菌株耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好，且能較顯著改善犬腸道環(huán)境，促進微生態(tài)平衡從而降低腹瀉率。該菌株已于2011年4月20日由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC?N0：M2011134。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：倪學勤，曾東，李潔萍，曾燕，舒剛，景波，彭煥偉，
申請(專利權)人：四川農業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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