應(yīng)用基于小麥EST序列的黑麥染色體特異分子標(biāo)記對黑麥5R染色體進行鑒定的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了基于小麥EST序列的黑麥5R染色體特異的分子標(biāo)記，此分子標(biāo)記為根據(jù)小麥染色體上的表達序列標(biāo)簽序列而設(shè)計的正向引物和反向引物，用于鑒定黑麥5R染色體的特異標(biāo)記；應(yīng)用這些分子標(biāo)記對黑麥5R染色體進行鑒定的基本步驟包括：A、標(biāo)記引物的選定和制備；B、標(biāo)記引物的稀釋；C、黑麥染色體的特異標(biāo)記：C-1、模板DNA的提取，C-2、PCR擴增，C-3、擴增產(chǎn)物的檢測，C-4、結(jié)果比對。本發(fā)明專利技術(shù)基于小麥染色體上的EST序列設(shè)計開發(fā)出了一套黑麥染色體的特異分子標(biāo)記，借助此分子標(biāo)記能夠用普通PCR技術(shù)快速、準(zhǔn)確的鑒定小麥遺傳背景中的5R黑麥染色體，為黑麥染色體上的有益基因轉(zhuǎn)移到栽培小麥背景中提供了簡便有效的分子鑒定方法。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)和遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及基于小麥表達序列標(biāo)簽(expressed sequence tag, EST)序列設(shè)計的分子標(biāo)記，以及這些分子標(biāo)記在跟蹤檢測黑麥染色體方面的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
小麥的近緣種黑麥cereale L.)具有許多優(yōu)良的性狀，如根系發(fā)達、分蘗強、抗旱、耐瘠薄、耐寒、耐鹽堿和酸性土壤，尤其是抗多種病害，如小麥白粉病iBlumeriagraminis f. sp. triiici)、條鎊病graminis f. sp. triiici )、口十鎊病(/*·triticina Eriks.)、桿鎊病(/*· graminis Pers. f. sp. triiici )、月星黑糖病(TilletiaControversa Kuhn, TCK)和大麥黃矮病(Barley yellow dwarf virus, BYDV)等。因此，黑麥?zhǔn)菍π←溸M行遺傳改良，拓寬小麥遺傳基礎(chǔ)，增加小麥栽培品種遺傳變異的重要基因源。 黑麥中優(yōu)異基因向小麥中轉(zhuǎn)移的途徑主要是創(chuàng)制一系列小麥/黑麥雙二倍體、附加系、代換系和易位系。通過遠緣雜交和染色體工程等手段將黑麥染色體導(dǎo)入到小麥背景中，之后，還需要對其進行準(zhǔn)確的鑒定，才能有效地加以利用。與細胞學(xué)技術(shù)和生化標(biāo)記法相比，分子標(biāo)記法簡單、快速和準(zhǔn)確的特點使其廣泛地用于檢測、跟蹤導(dǎo)入小麥背景中的黑麥染色體。然而，目前開發(fā)的黑麥染色體的特異標(biāo)記，多集中在黑麥的IRS染色體上，如SSR 標(biāo)記 Bmac0213 (參考文獻Schneider A and Molnar-Lang Μ. 2008. Polymorphismanalysis using IRS-specific molecular markers in rye cultivars {Secale cerealeL.) of various origin. Cereal Res Commun, 36: 11-19), SSAP 標(biāo)記 S10, S20, S17 (參考文獻:Nagy ED and Lelley T. 2003. Genetic and physical mapping of sequencespecific amplified polymorphic (SSAP) markers on the IRS chromosome arm in awheat background. Theor Appl Genet, 107: 1271-1277)，EST-STS 標(biāo)記 STSwe3 和 STSwel26(參考文獻Wang CM, Li LH, Zhang XT, Gao Q, Wang RF, andAn DG. 2009. Developmentand application of EST-STS markers specific to chromosome IRS of Secale cereale.Cereal Research Communications 37: 13-21)等。Zhuang 等(2008)報道了 1R,4R,5R,7R 染色體特異的 EST-SSR 標(biāo)記(參考文獻Zhuang LF, Song LX, Feng YG, Qian BL,Xu HB, Pei ZY, Qi ZJ. 2008. Development and chromosome mapping of new wheatEST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added inwheat. Acta Agron Sin, 34: 926-933)。Lee 等(2009)還報道了 6 個 2RL 染色體特異的EST標(biāo)記(參考文獻Lee TG, Hong MJ, Johnson JW, Bland DE, Kim DY, Seo Yff. 2009.Development and functional assessment of EST—derived 2RL_specific markers for2BS. 2RL translocations. Theor Appl Genet, 119: 663-673)。以普通小麥EST序列開發(fā)分子標(biāo)記，這樣的分子標(biāo)記在其近緣物種中表現(xiàn)出很高的可轉(zhuǎn)移性(參考文獻Zhang LY, Bernard M, Leroy P, Feuillet C，Sourdille P.2005. High transferability of bread wheat EST-derived SSRs to other cereals.Theor Appl Genet, 111: 677-687)。Zhang 等(2007)(參考文獻Zhang LY, Bernard M,Ravel C, Balfourier F, Leroy P, Feuillet C, Sourdille P. 2007. Wheat EST-SSRsfor tracing chromosome segments from a wide range of grass species. PlantBreeding, 126: 251-258)進一步報道了小麥的EST標(biāo)記能夠被用來跟蹤其許多近緣種的染色體片段。因此，利用小麥的EST序列來開發(fā)黑麥染色體特異的分子標(biāo)記十分可行。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提供一套基于小麥染色體上的EST序列而設(shè)計開發(fā)出的黑麥染色體特異的分子標(biāo)記，借助這些分子標(biāo)記能夠用普通PCR技術(shù)快速、準(zhǔn)確的鑒定小麥遺傳背景中的IR 7R全部黑麥染色體，為黑麥染色體上的有益基因轉(zhuǎn)移到栽培小麥背景中提供簡便有效的分子鑒定方法。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)所采取的技術(shù)方案是 基于小麥EST序列的黑麥IR 7R染色體特異的分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記為根據(jù)小麥染色體上的EST序列而設(shè)計的正向引物和反向引物，這些分子標(biāo)記為用于鑒定黑麥IR 7R染色體的特異標(biāo)記，其堿基序列見表1， 表1.根據(jù)小麥染色體表達序列標(biāo)簽序列而設(shè)計的17對標(biāo)記引物序列本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
應(yīng)用基于小麥EST序列的黑麥染色體特異分子標(biāo)記對黑麥5R染色體進行鑒定的方法，其特征步驟包括：A、分子標(biāo)記的選定和制備：合成標(biāo)記引物“11?MAG1242”，其正向引物序列見SEQ?ID?NO：21，其反向引物序列見SEQ?ID?NO：22；B、標(biāo)記引物的稀釋：將上步合成的標(biāo)記引物，先用1×TE緩沖液溶解成100mmol?L?1的母液放入?20℃的冰箱中保存，使用前吸取母液用超純水稀釋成10mmol?L?1的工作液待用；其中1×TE緩沖液的配方為，10mmol?L?1?Tris?HCl與1mmol?L?1?EDTA，pH=8.0；C、黑麥染色體的特異標(biāo)記：C?1、模板DNA的提取：取待測物——小麥與黑麥的遠緣雜交后代材料，對照物0——不包含待測黑麥染色體的樣品，對照物1——包含待測黑麥染色體的樣品，然后利用常規(guī)DNA提取方法分別提取三者的DNA；C?2、PCR擴增：以C?1所得DNA樣品為模板，利用步驟B所得工作液在PCR擴增儀中分別對待測物、對照物0及對照物1進行擴增；C?3、擴增產(chǎn)物的檢測：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟C?2所得的擴增產(chǎn)物，用銀染法進行染色，并在凝膠成像儀上照相；C?4、結(jié)果比對：將待測遠緣雜交后代材料的電泳圖譜分別與對照物0、對照物1的電泳圖譜進行比對，如果待測遠緣雜交后代材料和對照物1的電泳圖譜均有特異擴增片段，說明遠緣雜交后代材料中有待測黑麥染色體；如果待測遠緣雜交后代材料的電泳圖譜與對照物0的電泳圖譜一致，均不含有特異擴增片段，說明遠緣雜交后代材料中不含有待測黑麥染色體。...

【技術(shù)特征摘要】
1.應(yīng)用基于小麥EST序列的黒麥染色體特異分子標(biāo)記對黒麥5R染色體進行鑒定的方法，其特征步驟包括 A、分子標(biāo)記的選定和制備合成標(biāo)記引物“11-MAG1242”，其正向引物序列見SEQ IDNO :21，其反向引物序列見SEQ ID NO 22 ； B、標(biāo)記引物的稀釋將上步合成的標(biāo)記引物，先用IXTE緩沖液溶解成IOOmmolじ1的母液放入-20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超純水稀釋成IOmmolじ1的工作液待用；其中 IXTE 緩沖液的配方為，IOmmol じ1 Tris-HCl 與 Immol じ1 EDTA, pH=8. 0 ； C、黒麥染色體的特異標(biāo)記 C-1、模板DNA的提取取待測物——小麥與黒麥的遠緣雜交后代材料，對照物0——不包含待測黑麥染色體的樣品，對照物I——包含待測黑麥染色體的樣品，然后利用常規(guī)DNA提取方法分別提取三者的DNA ； C-2、PCR擴增以C-1所得DNA樣品為模板，利用步驟B所得工作液在PCR擴增儀中分別對待測物、對照物0及對照物I進行擴增； C-3、擴增產(chǎn)物的檢測非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟C-2所得的擴增產(chǎn)物，用銀染法進行染色，并在凝膠成像儀上照相； C-4、結(jié)果比對將待測遠緣雜交后代材料的電泳圖譜分別與對照物O、對照物I的電泳圖譜進行比對，如果待測遠緣雜交后代材料和對照物I的電泳圖譜均有...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：許紅星，尹冬冬，安調(diào)過，李立會，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：