長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測技術制造技術

一種分子生物技術領域的用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，包括引物、探針及其試劑盒，該試劑盒由PCR擴增試劑組、SAP酶試劑組、iPLEX試劑組構成；PCR擴增試劑組含有：PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合液、HotstarTaq酶、純水和如SEQIDNo.1~3所示的上游引物和如SEQIDNo.4~6所示的下游引物；SAP酶試劑組含有：SAP緩沖液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有：iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQIDNo.7~9所示的單堿基延伸引物；利用該試劑盒將腫瘤患者的DNA提取并處理后，可利用飛行質譜方法，檢測引物擴增片段內的生物標記，并基于檢測結果評價腫瘤患者對長春堿類藥物的敏感度，結果準確，靈敏度高，方法快速簡便并且有很高通量。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及的是一種分子生物
的檢測方法，包括引物、探針及其試劑盒，具體是一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，針對長春堿類藥物使用者基因內3個生物標記的引物、探針及其試劑盒。
技術介紹
化療在目前是惡性腫瘤治療的重要手段，臨床化療的效果對于腫瘤患者的治療和提高生存期有著至關重要的影響。對于不同的患者，不同的化療藥物的效果差異很大；腫瘤患者對化療的反應不同，很多時候是由于對化療藥物敏感性存在差異；由于臨床醫生往往只能憑經驗對不同患者使用某種化療藥物或化療方案，帶有一定的盲目性，因此很多腫瘤患者的化療效果并不理想，往往達不到化療的預期目的；所以，一個能夠在化療前篩選出針對性強、患者敏感度較高化療藥物的檢測方法，對于提高個體化治療效果，提高化療的成功率，有著重要的意義。近年來國內外腫瘤和化療藥物研究領域相繼創建了一系列體內或體外預測腫瘤化療藥物敏感性的方法；常用的有裸鼠皮下移植藥敏測定法、人體腫瘤細胞集落測定法、放射性標記代謝物前體摻入法、MTT比色、三磷酸腺苷法和快速熒光分析等等；這些方法均存在一些缺點，要么費用昂貴且檢測周期長，不適合常規使用；要么需要在體外培養原發腫瘤，檢測成功率低；這些缺陷把腫瘤化療藥敏實驗限制在了研究性的實驗室里，很少有大規模使用的報道。藥物基因組 學(pharmacogenomics)研究的進展為從分子水平研制和開發新一代的，針對藥物敏感性進行檢測的試劑盒提供了理論基礎和大量的實驗數據；實驗證明，個體基因水平上的差異，包括基因多態性、基因突變和表達差異等，與腫瘤患者對藥物的敏感性密切相關；通過檢測患者在這些基因上與藥物敏感性相關的生物標記，可以預測患者對腫瘤化療藥物的敏感性，幫助進一步指導選擇合理的化療方案。長春堿類藥物是從夾竹桃科植物長春花中提取的生物堿。此類化合物具有抗腫瘤活性，目前被應用與臨床化療中的有長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞賓等多種藥物，主要用于何杰金氏病和絨毛膜癌；長春堿類化合物可以與細胞中的微管蛋白結合，抑制微管聚合，妨礙紡錘體微管的形成，使細胞分裂停滯在中期；長春堿類藥物通過干擾細胞周期的正常進行，抑制細胞的分裂增殖，從而達到抑制腫瘤細胞的效果。研究人員發現ABCBl基因上的幾個生物標記與長春堿類藥物敏感性密切相關；ABCBl基因編碼P糖蛋白(P-glycoprotein P_gp),是一種廣譜的多藥外排泵；P_ gp可以通過它的疏水位點與疏水性抗腫瘤藥物結合，通過ATP水解供能，逆濃度梯度將藥物泵出細胞外，導致細胞內藥物濃度降低而產生耐藥；P_gp的轉運底物包括長春堿類化合物，因此ABCBl的基因變化導致個體對長春堿類藥物的敏感性不同；通過設計試劑盒，檢測ABCBl基因上的多個SNP生物標記，可以方便、快速的預測長春堿類藥物對患者個體的療效。
技術實現思路
本專利技術的目的是利用SNP標記檢測方便快捷，準確率高的優點，采用Seqnome檢測技術，提供一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，包括PRC弓I物、延伸弓I物和試劑盒。本專利技術是通過以下技術方案實現的:本專利技術涉及一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的PCR擴增引物，含有SEQ ID N0.1 3所示的上游引物和SEQ ID N0.4 6所示的下游引物。本專利技術涉及一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的單堿基延伸引物，含有SEQ ID N0.7 9所示的單堿基延伸引物。本專利技術設計一種試劑盒，由PCR擴增試劑組、SAP酶試劑組和iPLEX試劑組構成，其中PCR擴增試劑組含有:PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如SEQID N0.1 3所示的上游引物和如SEQ ID N0.4 6所示的下游引物；SAP酶試劑組含有:SAP緩沖液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有:iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ ID N0.7 9所示的單堿基延伸引物。上述標記組合優選利用飛行質譜(MALD1-T0F)方法進行檢測，檢測方法包括以下步驟: (1)提取基因組DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮細胞DNA； (2)飛行質譜檢測SNP多態； (3)根據SNP分型結果推斷長春堿類藥物敏感度。`本專利技術對ABCBl基因上的三個SNP生物標記進行分型，建立了一個快速，簡便，且成本低廉的檢測試劑盒，該試劑盒準確度高，靈敏性好，具有很強的實用價值。具體實施例方式實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例1:采用飛行質譜方法對腫瘤患者進行SNP分型及長春堿類藥物敏感度檢測: 一)提取基因組DNA:本試驗的樣本是使用刮棒采集的口腔粘膜細胞，室溫保存，刮棒采樣DNA提取的具體步驟如下:將口腔刮棒上的脫落細胞溶于400 μ L IX裂解液中，加入Iμ L蛋白酶K，56度水浴30分鐘；取出樣品置冰水浴I分鐘，加入6mol/L NaCl 150 μ L，劇烈振蕩15-20秒，13000轉離心10分鐘；吸取上清液至新的離心管中，加入1.1mL無水乙醇，上下顛倒10次至絮狀DNA沉淀出現。室溫放置10分鐘，13000轉離心2分鐘沉淀DNA ;棄去上清液，再加入0.25mL70%乙醇洗滌DNA沉淀，室溫放置I分鐘后，13000轉離心5分鐘；用移液器小心吸取乙醇，然后放入通風櫥中通風10分鐘，然后用35 μ L TE溶解DNA ;DNA可在4度保存1-2個月，或者存放在-20度長期保存；使用18PL PCR Master Mix反應液以及2PL DNA模板，PCR擴增β -actin片斷，1.5%瓊脂糖凝膠，120V電泳15分鐘，觀察結果合格后轉移至PCR管中；紫外分光光度計SMA3000測定溶液中DNA的濃度和A260/A280比值，測量3次取平均值，濃度應在30ng/y L，A260/A280比值應該在1.7-2.0之間，合格的DNA 4°C取用或_20°C保存； 二)飛行質譜檢測SNP多態采用本專利技術中所述試劑盒對樣本中的SNP生物標記進行檢測，下面為檢測過程: 1)引物與DNA稀釋以及質檢:PCR引物稀釋至終濃度為0.5μΜ ;根據Sequenom的稀釋公式，按照單堿基延伸引物的分子量將引物稀釋至終濃度為7-14 μ M之間； 2)PCR擴增:在每個384孔PCR板中加入Iμ L DNA和4 μ L PCR擴增試劑，共5 μ L，按照PCR儀程序I進行擴增；PCR擴增程序1:94°C 15min本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的PCR擴增引物，其特征在于，包含SEQ?ID?No.1?~3所示的上游引物和SEQ?ID?No.4~6所示的下游引物。

【技術特征摘要】
1.一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的PCR擴增引物，其特征在于，包含SEQID N0.1 3所示的上游引物和SEQ ID N0.4 6所示的下游引物。2.一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的弓I物單堿基延伸引物，其特征在于，包含SEQ ID N0.7 9所示的單堿基延伸引物。3.一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，其特征在于，由PCR擴增試劑組、SAP試劑組、iPLEX試劑組構成: [ 1)PCR擴增試劑組含有:PCR緩沖液、MgCl2, dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如SEQ ID N0.1 3所示的上游引物和如SEQ ID N0.4 6所示的下游引物； [2)SAP酶試劑組含有:SAP緩沖液、SAP酶和純水； [3)iPLEX試劑組含有:iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ IDN0.7、所示的單堿基延伸引物。4.根據權力要求3所述的方法制造的試劑盒，包括具有一系列特征的試劑盒: [1)根據權利...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王健，其他發明人請求不公開姓名，
申請(專利權)人：上海迪道科技有限公司，郭景康，
類型：發明
國別省市：