本發明專利技術涉及具有C4-二羧酸轉運蛋白活性的分離的多肽，和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明專利技術亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生和使用所述多肽的方法，和產生C4-二羧酸如蘋果酸的方法。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及具有C4-二羧酸轉運蛋白活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。本專利技術亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生和使用所述多肽的方法，和產生C4- 二羧酸如蘋果酸的方法。
技術介紹
有機酸在多種工業中具有悠久歷史的商業使用。舉例而言，有機酸用于食品和飼料工業(檸檬酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸和葡糖酸)，作為用于產生多種聚合物的單體(己二酸、乳酸、丙烯酸和衣康酸)，作為金屬螯合劑(葡糖酸)和作為“綠色”溶劑(乙酸)(Sauer 等，2008，Trends in Biotechnology26:100-108)。有機酸自身可為商業產品或其可為用于制造其他化學品的化學構件(building block)。除了專門用途之外，長久以來公認C4- 二羧酸亦可充當構件化合物以供產生大體積的工業化學品，如1，4- 丁二醇，四氫呋喃和Y-丁內酯。由于石油衍生構件的高成本,通過傳統石油化學途徑產生這些大體積工業化學品的成本顯著增加。有機酸在商業上是通過從石油衍生原料的化學合成(例如，延胡索酸、蘋果酸、丙烯酸和己二酸)或通過微生物發酵(例如檸檬酸、乳酸、葡糖酸和衣康酸)產生的。一些有機酸如延胡索酸和蘋果酸亦可通過微生物發酵來產生，但由于更低的生產成本，目前在商業上仍通過化學合成從石油化學原料產生。然而，石油衍生構件化學品的成本的日益升高，地緣政治的不穩定性對原油價格的影響，以及對實施利用來源于可再生資源的原料的制造工藝的期望，刺激了通過微生物發酵產生有機酸和其他化學品中的重建的興趣。雖然現在通過化學合成從石油化學原料商業性產生蘋果酸，其亦可通過微生物發酵產生。蘋果酸已在基因工程改造的酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisia))(Zelle 等，2008, Appl.Environ.Microbiol.74:2766-2777)和天然存在的絲狀真菌如曲霉屬菌種(Aspergillus spp.)(美國專利號 3, 063, 910;Bercovitz 等,1990, Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)中以高水平產生。Abe 等(美國專利號 3，063，910)和 Bercovitz等(1990, Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)報道了在幾種曲霉屬菌種中高水平的蘋果酸產生。而且，Battat 等(1991, Biotechnol.Bioengineering, 37:1108-1116)報道了在優化條件下在攪拌的發酵罐中由黃曲霉(Aspergillus flavus)產生了高至113g/L的蘋果酸。在W02010/003728中描述了在酵母中通過微生物發酵產生二羧酸。亦在W02009/011974和W02009/155382中描述了通過微生物發酵產生蘋果酸。通過對曲霉屬(Aspergillus)進行遺傳工程改造改善蘋果酸產生會使得能夠通過發酵經濟地商業性生產蘋果酸。曲霉屬菌種(Aspergillus spp.)中的蘋果酸過量產生在特定的培養條件(有氧條件和高C:N比；碳酸鈣亦作為中和劑和作為用于蘋果酸生物合成的CO2源添加)下發生。在這些條件下，通過胞質溶膠的、還原性三羧酸(TCA)循環的溢出代謝(overflowmetabolism)導致增加的蘋果酸生物合成和分泌入培養基。已在釀酒酵母中報道了通過使用遺傳工程增加丙酮酸羧化酶(Bauer等，1999，FEMSMicrobiol Lett.179:107-113)或蘋果酸脫氫酶(Pines 等，1997, Appl.Microbiol.Biotechnol.48:248-255)的水平和增加蘋果酸轉運蛋白的表達(Zelle等，2008，見上)而增加蘋果酸產生?；谏锘瘜W證據，提出了在黃曲霉菌株ATCC13697中，蘋果酸脫氫酶活性限制蘋果酸產生(Peleg等，1988，Appl.Microbiol.Biotechnol.28:69-75)。2010 年 8 月 27 日提交、題為“Methods for ImprovingMalicAcid Production in Filamentous Fungi ”的 PCT 申請號 PCT/US10/47002 (其內容通過提述以其整體并入本文)描述了絲狀真菌中的蘋果酸產生。在本領域中，在曲霉屬中作為使用重組DNA技術的遺傳工程改造的結果而改善C4- 二羧酸產生如蘋果酸產生會是有益的。本專利技術提供了具有C4- 二羧酸轉運蛋白活性的多肽，編碼所述多肽的多核苷酸，和用于改善C4-二羧酸產生(例如蘋果酸產生)的方法坐寸ο
技術實現思路
本專利技術涉及具有C4-二羧酸轉運蛋白活性的分離的多肽。在一個方面，所述具有C4-二羧酸轉運蛋白活性的分離的多肽選自:(a)多肽，其與SEQ ID NO: 2、4或6，或其成熟多肽序列具有至少65%序列同一'丨生；(b)多肽,其由多核苷酸編碼,所述多核苷酸與SEQ IDNO:1、3或5，或其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長互補鏈在低嚴格條件下雜交；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述`多核苷酸與SEQ ID NO: 1、3或5，或其成熟多肽編碼序列具有至少65%序列同一性；(d) SEQ ID NO: 2、4或6，或其成熟多肽序列的包含一個或多個(例如兩個，幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和(e) (a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有C4- 二羧酸轉運蛋白活性的片段。本專利技術亦涉及產生C4-二羧酸(例如蘋果酸)的方法。在一個方面，該方法包括:(a)培養宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞)，所述宿主細胞包含編碼本文中所述的C4-二羧酸轉運蛋白的異源多核苷酸；和(b)回收所述C4-二羧酸(例如蘋果酸)。在另一個方面，該方法包括(a)將編碼本文中所述的C4-二羧酸轉運蛋白的異源多核苷酸轉化入宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞)；(b)在培養基中培養經轉化的生物；和(c)回收所述C4-二羧酸(例如蘋果酸)。在所述方法的一些方面，所述宿主細胞進一步包含編碼蘋果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。本專利技術還涉及宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞，如米曲霉(AspergiIIusoryzae)),所述宿主細胞包含本文中所述的編碼C4- 二羧酸轉運蛋白的異源多核苷酸，其中所述宿主細胞分泌和/或能夠分泌增加水平的C4- 二羧酸(例如蘋果酸)。在一些方面，所述宿主細胞進一步包含編碼蘋果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。本專利技術亦涉及信號肽和編碼該信號肽的多核苷酸。在一個方面，本專利技術涉及多核苷酸，其編碼可操作地連接于編碼蛋白的基因的信號肽，所述信號肽包含或組成為(consisting of) SEQ ID NO: 2的氨基酸I至61或I至68。在另一個方面,本專利技術涉及多核苷酸，其編碼可操作地連接于編碼蛋白的基因的信號肽，所述信號肽包含或組成為SEQ IDN0:4的氨基酸I至17。在另一個方面，本專利技術涉及多核苷酸，其編碼可操作地連接于編碼蛋白的基因的信號肽，所述信號肽包含或組成為SEQ ID N0:6的氨基酸I至68。本專利技術亦涉及包含本文中所述的多肽的組合物，編碼所述多肽的分離的多核苷酸，包含所述本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.06.21 US 61/356,8681.一種具有C4-二羧酸轉運蛋白活性的分離的多肽，其選自: (a)多肽，其與SEQID NO: 2、4或6，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件與以下雜交:SEQ IDNO: 1、3或5，其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長互補鏈； (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQID NO: 1、3或5，其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一 I生; (d)SEQID NO: 2、4或6，或其成熟多肽序列的包含一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和 (e)(a)、(b)、(C)或(d)的多肽具有C4-二羧酸轉運蛋白活性的片段。2.權利要求1的多肽，其與SEQID NO: 2、4或6，或其成熟多肽序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。3.權利要求1或2的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，低-中等嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件下，或非常高嚴格條件與以下雜交:SEQ ID NO: 1、3或5， 其成熟多肽編碼序列，或前述序列的全長互補鏈。4.權利要求1-3任一項的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDΝΟ:1、3或5，或其成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%,至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。5.權利要求1-4任一項的多肽，其包含或組成為SEQID NO:2、4或6。6.權利要求1-4任一項的多肽，其包含或組成為SEQID NO:2、4或6的成熟多肽。7.權利要求6的多肽，其中所述SEQID NO:2的成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸62至397或69至397 ID NO: 4的成熟多肽是SEQ IDNO: 4的氨基酸18至418 ;和所述SEQ ID N0:6的成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸69至397。8.權利要求1-7任一項的多肽，其中所述多肽由大腸桿菌NRRLB-50400中包含的質粒pAaC4T737中包含...
【專利技術屬性】
技術研發人員：A費希爾，D亞弗，
申請(專利權)人：諾維信股份有限公司，
類型：
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。