本發(fā)明專利技術公開了一種編碼前導序列的分離的核酸，其具有一特定序列，以及公開了由該核酸編碼的分離的前導肽、包括編碼前導序列的這種核酸的表達組件，該核酸可操作地連接到編碼POI的核酸序列上，本發(fā)明專利技術公開了一包括該表達組件的重組酵母宿主細胞或載體，一種在該酵母宿主細胞中生產POI的方法，以及進一步地，公開了該特定核酸用于從宿主細胞分泌POI和/或增加來自宿主細胞的POI的分泌的用途。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】表達序列 本專利技術涉及巴斯德畢赤酵母（P. pastoris)表達系統(tǒng)的調節(jié)元件，以及它們在生 產目標蛋白（POI)的方法中的用途。
技術介紹
已在原核和真核宿主中成功實現(xiàn)蛋白分泌。最突出的例子是細菌如大腸桿菌，酵 母菌如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、漢遜酵母（Hansenula polymorpha)，絲狀真菌如泡盛曲 霉或里氏木霉，或哺乳動物細胞如CHO細胞。盡管一些蛋白可以容易地實現(xiàn)高效率分泌，但 是很多其他蛋白僅以相對較低的水平分泌。 基因在宿主生物體內的異源表達需要一載體，允許宿主生物體的穩(wěn)定轉化。該載 體或表達組件需為基因提供一功能性啟動子，該啟動子位于編碼序列的5'末端附近。轉錄 因此而受該啟動子序列調節(jié)和啟動。 分泌途徑通常開始于跨膜多肽和旨在分泌到內質網（ER)內腔的多肽的易位。為 此，這些蛋白具有氨基末端先導序列（precursing sequence)，也被稱作"前導序列"，其包 含一信號肽和一可選的分泌前導肽原，或由其組成。信號肽通常由13-36個相當疏水的氨 基酸組成。信號肽有一個共同的結構：一短的帶正電荷的氨基末端區(qū)域（n-區(qū)域）；一中 央疏水區(qū)域（h-區(qū)域）；和一極性較強的羧基末端區(qū)域（c區(qū)域），其中羧基末端區(qū)域包含 被信號肽酶切割的位點。在ER的內腔側，信號肽被信號肽酶切除。在通過ER伴侶和折 疊酶成功折疊新生多肽后，該蛋白進一步被引導移出ER。這一進程可得到N末端原序列 (pro-sequence)的支持，因為其存在于例如釀酒酵母交配因子a (MFa)的前體中。該蛋白 然后被運輸?shù)礁郀柣W絡并最終到達質膜從而分泌到上清液中。前導肽原（推測）被高爾 基內的蛋白酶如釀酒酵母的Kex2蛋白酶從該蛋白上切除。 由于大多數(shù)酵母并不分泌大量的內源性蛋白，并且它們的細胞外蛋白質組學目前 并未廣泛表征，因此，可獲得的用于酵母的分泌序列的數(shù)量是有限的。因此，采用融合目標 蛋白和釀酒酵母的交配因子a前導肽（MFa)的方式來驅動在多種酵母（包括畢赤酵母 屬、克魯維酵母屬、接合酵母屬）中的分泌表達。很可惜，由Kex2蛋白酶進行的MFa蛋白 酶解處理經常在產品中產生異源的N末端氨基酸殘基。 EP324274B1介紹了在酵母中的改進的異源蛋白的表達和分泌，其采用截短的釀酒 酵母a因子前導序列，EP301669B1描述了用于分泌異源蛋白的克魯維酵母a因子前導序 列。 或者，可用釀酒酵母磷酸酶（PH05, DK3614)、釀酒酵母蔗糖轉化酶（SUC， W084/01153)，以及酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3, EP792367B1)的信號肽用于酵母中的分泌 表達。EP0438200(A1)披露了用于在巴斯德畢赤酵母中表達的釀酒酵母SUC2的信號肽序 列。 US5268273描述了巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶（PHOl)信號序列，其在大多數(shù)情況 下弱于MFa。 US7741075描述了用于重組蛋白表達的巴斯德畢赤酵母PIRl分泌信號肽，以及用 于重組表面展示的巴斯德畢赤酵母PIRl和PIR2錨定域肽。 Khasa等人2011年（Yeast. 28(3):213-26)描述了巴斯德畢赤酵母PIR基因的 分離以及在細胞表面展示和重組蛋白分泌方面的應用，尤其是利用PpPirlp蛋白的前原 (pre-pro)信號在巴斯德畢赤酵母中進行的重組蛋白分泌，沒有與MFa進行對比。 W02011073367A1 和 Kottmeier 等人 2011 年（Applied Microbiology and Biotechnology. 91: 1，133-141)描述了一疏水蛋白信號序列，其介導重組蛋白在巴斯德畢 赤酵母中的高效分泌，尤其是使用里氏木霉疏水蛋白的前序列或原序列用于eGFP在巴斯 德畢赤酵母中的分泌。 在巴斯德畢赤酵母基因組測序過程中列出了 54種不同的序列作為預測的信號 肽，其包括一切割位點以提供蛋白的分泌。（De Schutter et al. Nature Biotechnology doi:10.1038/nbt. 15442009)。 US2011/0021378A1描述了經過鑒定的一組54個巴斯德畢赤酵母基因，其包括一 信號序列，在它們之中SEQ ID 8的第1-21個殘基列于US2011/0021378A1中，也包括一切 割位點以提供蛋白分泌。 EP2258855A1描述了巴斯德畢赤酵母來源的表達系統(tǒng)的調節(jié)序列，其中巴斯德畢 赤酵母Epxl蛋白的信號和前導肽序列用作57氨基酸先導序列以便于目標POI蛋白的表達 和分泌。用于信號肽酶的切割位點預計跟隨信號序列，即在位置20和21之間，顯示為切割 位點序列中的連字符：VSA-AP(SEQ ID 6)。 最好是能夠提供適合在重組真核宿主細胞內表達POI的替代的調節(jié)兀件，以及在 真核細胞內產生分泌性蛋白的簡單、高效的方法，該方法最好能使POI產生同種N末端。
技術實現(xiàn)思路
可通過本專利技術要求保護的主題來實現(xiàn)這個目標。 本專利技術提供一編碼前導序列的分離的核酸，該前導序列選自： a)具有SEQ ID 10的氨基酸序列的前導肽或其具有一個或兩個點突變的功能變 體， b)具有選自由SEQ ID 11、12、13和14組成的組的氨基酸序列的前導肽， c)具有SEQ ID 1的氨基酸序列的信號肽或其具有一個或兩個點突變的功能變體 (優(yōu)選排除SEQ ID 2)，以及 d)具有選自由SEQID2、3、4和5組成的組（優(yōu)選排除SEQID2)的氨基酸序列 的信號肽。 本專利技術進一步提供一前導序列，其選自： a)具有SEQID 10的氨基酸序列的前導肽或其具有一個或兩個點突變的功能變 體， b)具有選自由SEQ ID 11、12、13和14組成的組的氨基酸序列的前導肽， c)具有SEQID 1的氨基酸序列的信號肽或其具有一個或兩個點突變的功能變體 (優(yōu)選排除SEQID2)，以及 d)具有選自由SEQID2、3、4和5組成的組（優(yōu)選排除SEQID2)的氨基酸序列 的信號肽。 特異性前導肽因此通過一 36個氨基酸（aa)前導序列表征，其中N末端的20aa序 列是一特異性信號肽。 特異性信號肽因此通過一 20aa信號序列表征，特別地，排除C末端延伸序列，例如 一包括通過另外的氨基酸例如丙氨酸實現(xiàn)的C末端延伸的21aa序列。 SEQIDI:MKJSTNLILAIAAASXWSA，其中 位置3處的X是F或者L 位置16處的X是A或者T 例如，EpxL-A，一 20個氨基酸（aa)的信號肽，具有SEQID1的氨基酸序列，其中 位置3處的X是L，并且位置16處的X是A(SEQID2)。 根據一特定實例，該EpxL-A，一 20個氨基酸（aa)的信號肽，具有SEQID1的氨基 酸序列，其中位置3處的X是F，并且位置16處的X是A(SEQID3)。 具體而言，本專利技術提供一信號肽或一編碼該信號肽的核酸，該信號肽具有選自由 SEQID2、3、4和5組成的組的氨基酸序列。SEQID2 ：MKLSTNLILAIAAASAVVSASEQID3 ：MKF；STNLILAIAAASAVVSASEQID4 ：MKF;STNLILAIAAASTVVSA SEQID5 ：MKLSTNLILAIAA本文檔來自技高網...
【技術保護點】
編碼一前導序列的分離的核酸，該前導序列選自由：a)具有SEQ?ID?10的氨基酸序列的前導肽或其具有一個或兩個點突變的功能變體，以及b)具有選自SEQ?ID?11、12、13和14的氨基酸序列的前導肽，組成的組，優(yōu)選地，該核酸是一編碼前導肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自由SEQ?ID?18、19和20組成的組，或者是SEQ?ID?18、19或20中的任意一種的密碼子優(yōu)化的變體。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：B·加塞爾，D·馬塔諾維赫，S·海斯，
申請(專利權)人：龍沙有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：瑞士;CH
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