本發明專利技術公開了一種rhHER2抗體與MMAE偶聯物及其制備方法與應用。本發明專利技術通過用三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽還原rhHER2抗體，再將還原后的HER2抗體與MMAE的偶聯，得到rhHER2抗體與MMAE偶聯物。本發明專利技術制備方法簡單，得到的rhHER2抗體與MMAE偶聯物抗腫瘤效果強。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種抗體-小分子化合物偶聯物(ADC)，特別涉及一種rhHER2抗體與MMAE偶聯物及其制備方法與應用。
技術介紹
抗體藥物偶聯物(Antibody-DrugConjugate，ADC)是將具有特異性識別的單克隆抗體和高效殺傷力的小分子化合物通過一個具有連接功能的連接子連接在一起，形成的抗體藥物復合物。既能避免單克隆抗體后期產生的耐藥性導致的療效不佳，又能克服小分子損傷正常組織引起的副作用等缺點。目前有三個ADC藥物已經獲得了美國FDA批準上市，一個是gemtuzumAbozoGamicin(商品名Mylotarg，麥羅塔)，是由重組人源化lgG4單克隆抗體(吉妥珠單抗)與細胞毒抗腫瘤抗生素刺孢霉素(calicheamicin)偶聯而成。這個藥物已于2010年被撤出市場；另一個藥物是bren-tuximabvedotin(商品名Adecetris)，由CD30的單克隆抗體cAC10與MMAE相偶聯所構成，用于治療復發性霍奇金淋巴瘤(HL)和復發的系統性間變性大細胞淋巴瘤(sALCL)。另一個藥物是人表皮生長因子受體2(HER2)抗體與美登素衍生物DM1偶聯的藥物trastuzumabemtansine(簡稱T-DM1，商品名Kadcyla)，用于治療晚期轉移性乳腺癌。ADC藥物由三部分組成：抗體、小分子化合物和連接子。抗HER2人源化單克隆抗體作為腫瘤治療藥物在臨床試驗和后續應用中均取得了確切的療效，是目前最常用的ADC藥物的抗體。MMAE是除TM1之外的另一種最常使用的ADC荷載的化合物，它是一種細胞有絲分裂的抑制劑，來源于尾海兔毒素家族。MMAE本身對腫瘤的抑制作用并不高，但令人驚奇的是，MMAE與單克隆抗體，如anti-CD30抗體cAC10連接構成ADC后則具有很好的療效。連接子是ADC藥物的重要組成部分，因為不同的連接子會影響到ADC藥物的許多性質，如藥物在體內的半衰期、藥代動力學以及藥物的旁觀者效應(bystandereffect)。
技術實現思路
本專利技術的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種rhHER2抗體與MMAE偶聯物的制備方法。本專利技術的另一目的在于提供通過上述制備方法得到的rhHER2抗體與MMAE偶聯物。本專利技術的再一目的在于提供所述rhHER2抗體與MMAE偶聯物的應用。本專利技術的目的通過下述技術方案實現：一種rhHER2抗體與MMAE偶聯物的制備方法，包括如下步驟：(1)用三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽還原rhHER2抗體；(2)還原后的HER2抗體與MMAE的偶聯，得到rhHER2抗體與MMAE偶聯物。步驟(1)中所述的還原的條件優選為：三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽和rhHER2抗體按摩爾比1～4：1配比，于37℃還原30～120min；更優選為：三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽和rhHER2抗體按摩爾比3：1配比，于37℃還原30min。步驟(2)中所述的偶聯的條件優選為：MMAE與還原后的HER2抗體按摩爾比1～2：1配比，于0～37℃反應30～120min；更優選為：MMAE與還原后的HER2抗體按摩爾比1.5～2：1配比，于0℃反應120min。步驟(2)中所述的MMAE為含有連接子MC-Val-Cit-PAB的MMAE。一種rhHER2抗體與MMAE偶聯物，通過上述制備方法得到。所述的rhHER2抗體與MMAE偶聯物特別適用于制備抗腫瘤的藥物。所述的腫瘤優選為乳腺癌。本專利技術相對于現有技術具有如下的優點及效果：本專利技術提供的制備方法簡單，得到的rhHER2抗體與MMAE偶聯物抗腫瘤效果強。附圖說明圖1是抗體還原程度與還原劑量的關系圖。圖2是還原程度與還原時間的關系圖。圖3是PH-MMAE結構圖。圖4是檢測ADC的SDS-PAGE圖；其中，泳道1和2為還原條件下的PH-MMAE和抗體(PH)，泳道M為標準蛋白，泳道3和4分別為非還原條件下的抗體(PH)和PH-MMAE。圖5是PH-MMAE和PH親和力比較結果圖。圖6是PH-MMAE對BT-474細胞生長的抑制結果圖。圖7是PH-MMAE對SK-BR-3細胞生長的抑制結果圖。圖8是PH-MMAE對MDA-MB-231細胞生長的抑制結果圖。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本專利技術作進一步詳細的描述，但本專利技術的實施方式不限于此。實施例11、抗體的還原方法1.1還原劑加入量優化三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)簡稱為TCEP，是一種常用的高效還原劑，被廣泛用于蛋白質二硫鍵的還原。本研究選用TCEP作為抗體的還原劑，通過優化還原劑與抗體的投料比，獲得既不破壞抗體活性又能提高偶聯物活性的最佳還原劑量。分別選用TCEP/rhHER2抗體(簡稱PH，已在“抗人表皮生長因子受體2人源化單克隆抗體在中國倉鼠卵巢細胞中的表達、純化及活性測定.黃鸝等,中國藥學雜志：2012,47(11)：884-888”公開，其氨基酸序列同羅氏曲妥珠)的摩爾比＝1、2、3、4，在37℃水浴條件下，水浴120min，測定各自樣品中的巰基含量。1.2還原時間優化在摩爾比＝3，37℃水浴條件下，還原時間分別30min、60min、90min、120min，測定各自樣品中巰基含量。1.3還原產物鑒定(DTNB法)Ellman試劑，又稱DTNB，常用于定量檢測游離巰基含量。含巰基化合物能與DTNB與反應，使DTNB的二硫鍵斷裂，形成黃色化合物2-硝基-5-硫代苯甲酸(TNB)，其在412nm處有特定的吸收。利用已知含量的巰基化合物作為標準品，繪制標準曲線，將樣品測量值與標準曲線對比即可定量樣品中巰基的量。①常溫下，將L-cys(L-半胱氨酸)標準溶液用0.25MTris-HCl稀釋成濃度分別為5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml。②取10μl樣品與190μlDTNB分析試劑混勻，靜止10min。選用200μlDTNB分析試劑作為空白對照。③使用酶標儀測定樣品在412nm處吸光值。結果：1.1還原劑加入量優化實驗分別選取還原劑(TCEP)與rhHER2抗體的投料摩爾比為1、2、3、4，還原后運用DTNB法，測定還原樣品中巰基含量，根據巰基含量判斷抗體還原程度。根據還原劑量與抗體還原程度的關系(如圖1所示)，在還原劑與抗體(PH)的投料摩爾比為3時，毒素分子偶聯數N趨近于4本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種rhHER2抗體與MMAE偶聯物的制備方法，其特征在于包括如下步驟：(1)用三(2?羧乙基)膦鹽酸鹽還原rhHER2抗體；(2)還原后的HER2抗體與MMAE的偶聯，得到rhHER2抗體與MMAE偶聯物。
【技術特征摘要】
1.一種rhHER2抗體與MMAE偶聯物的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)用三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽還原rhHER2抗體；
(2)還原后的HER2抗體與MMAE的偶聯，得到rhHER2抗體與MMAE偶聯物。
2.根據權利要求1所述rhHER2抗體與MMAE偶聯物的制備方法，其特征在于：步驟
(1)中所述的還原的條件為：三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽和rhHER2抗體按摩爾比1～4：1配比，
于37℃還原30～120min。
3.根據權利要求2所述rhHER2抗體與MMAE偶聯物的制備方法，其特征在于：步驟
(1)中所述的還原的條件為：三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽和rhHER2抗體按摩爾比3：1配比，于
37℃還原30min。
4.根據權利要求1所述rhHER2抗體與MMAE偶聯物的制備方法，其特征在于：步驟
(2)中所述的偶聯的條件為：MMAE與還原后...
【專利技術屬性】
技術研發人員：謝秋玲，熊盛，洪岸，
申請(專利權)人：暨南大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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