一種制備聚乙二醇化蛋白的組合物的方法技術

本發明專利技術涉及蛋白質聚乙二醇化的領域。具體地，本發明專利技術涉及用于聚乙二醇化治療性蛋白質的方法。本發明專利技術還涉及這樣的聚乙二醇化治療性多肽用于治療肌肉疾病和疾患的用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術是蛋白質聚乙二醇化的領域。特別是，本專利技術涉及聚乙二醇化的治療性蛋白質，如聚乙二醇化的IGF-1多肽和其變體。
技術介紹
使用聚乙二醇(PEG)共價修飾蛋白質已被證明是延長蛋白質在體內循環半衰期的有效方法(Hershfield,M.S.,等人,N.Engl.J.Med.316(1987)589-596；Meyers,F.J.等人,Clin.Pharmacol.Ther.49(1991)307-313；Delgado,C等人,Crit.Rev.Ther.Drug)。這個方法被稱為聚乙二醇化，其是最成熟的、并成功地用于改善藥學活性蛋白質的治療價值的技術(Roberts等人,Chemistry for peptide and protein PEGylation.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476；Caliceti P.等人,2003)。PEG鏈附著到蛋白質增加其分子量和流體動力學半徑，導致顯著的體內半衰期延長。纏繞蛋白質的PEG鏈對蛋白質具有屏蔽作用，因而降低蛋白水解降解和綴合物的免疫原性。聚乙二醇化也改變生物分布特性和顯著增加疏水性蛋白質的溶解度(Caliceti,P.和Veronese,F.M.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv.Drug Deliv.Rev.,55,1261.,Roberts等人,Chemistry for peptide and protein PEGylation.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476；)。通過使用甲氧基聚乙二醇的N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-hydroxysuccinimmidyl)(PEG-NHS)實現的偶聯化學作用，可以導致在不同賴氨酸殘基上綴合，形成位置亞型和多聚乙二醇化形式的復雜混合物。在治療中已經被使用數年的幾種綴合物是隨機聚乙二醇化化學作用的結果。隨機聚乙二醇化的主要缺點是缺少最終產品的同質性。因此可預期反應再現性的困難和最終產品的分析表征中的挑戰。胰島素樣生長因子(IGF)是一個復雜系統的一部分，其中細胞使用其與其生理環境聯系。這種復雜系統(通常被稱為胰島素樣生長因子軸)由兩個細胞表面受體(IGF-1R和IGF-2R)、兩個配體(IGF-1和IGF-2)、六個高親和性IGF結合蛋白(IGFBP 1-6)的家族、以及相關的IGFBP降解酶(蛋白酶)組成。這個系統不僅對正常生理的調節是非常重要的，也對一些病理狀態是非常重要的(Glass,Nat Cell Biol 5:87-90,2003)。IGF軸已被證明在促進細胞增殖和抑制細胞死亡(細胞凋亡)中發揮作用。IGF-1主要由人生長激素(hGH)刺激肝臟后分泌。幾乎在人體內的每個細胞均受IGF-1影響，特別是肌肉、軟骨、骨、肝、腎、神經、皮膚和肺中的細胞。除了胰島素樣作用外，IGF-1也能調節細胞生長。IGF-1和IGF-2由稱為IGF結合蛋白的基因產物家族調節。這些蛋白質以復雜的方式幫助調節IGF活性，包括通過防止結合到IGF受體而抑制IGF活性。人IGF-1，也被稱為生長調節素的成熟形式，是70個氨基酸的小蛋白質，已經表明其刺激培養中多種細胞的生長。IGF-1蛋白最初由三個已知的剪接變體mRNA編碼。各mRNA的開放閱讀框編碼含有70個氨基酸的IGF-1(SEQ ID NO：1)和在C-末端的特定的E-肽(這取決于特定的IGF-1mRNA)的前體蛋白。這些E-肽被稱為Ea(rsvraqrhtdmpktq.kevhlknasrgsagnknyrm；SEQ ID NO：2)，Eb(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk；SEQ ID NO：3)和Ec(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk；SEQ ID NO：4)肽，長度范圍35至87個氨基酸，并且包含N-末端的共同序列區和C末端的可變序列區。例如，IGF-1-Ea的野生型開放閱讀框編碼135個氨基酸的多肽，其包括前導序列和無前導序列的105個氨基酸的多肽(gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm；SEQ ID NO：5)。在生理表達時，E-肽通過內源性蛋白酶從前體裂解以產生成熟的70個氨基酸的IGF-1。在人血清中IGF-1的可用性和半衰期主要受蛋白酶和IGF-1結合蛋白(IGFBP’s)的影響和調節。IGFBP’s既可以抑制又可以加強IGF-1活性(Oh Y,等人,Characterization of the affinities of insulin-like growth factor(IGF)-binding proteins 1-4for IGF-I,IGF-II,IGF-I/insulin hybrid,and IGF-I analogs.Endocrinology.1993Mar；132(3):1337-44)。增加IGF-1半衰期的策略已經在現有技術中描述。已考慮的策略是：(ⅰ)生成含有特異性突變的IGF-1變體，旨在防止在人血清中通過絲氨酸蛋白酶裂解IGF-1，或者減輕IGF-1結合蛋白對IGF-1可用性或血清半衰期的負面影響(WO200040613，WO05033134，WO2006074390，WO2007146689)；(ⅱ)生成IGF-1融合蛋白，其中成熟的IGF-1蛋白融合到人免疫球蛋白Fc區(WO2005033134，WO200040613)；(iii)使用IGF-1前體蛋白，其中通過修飾前體蛋白降低蛋白酶導致的E-肽從IGF-1的裂解(WO2007146689)；(ⅳ)組合上述策略((ⅰ)/(ⅱ)WO05033134，(ⅰ)/(ⅱ)WO200040613，(ⅰ)/(ⅲ)WO2007146689)，以及(v)生成聚乙二醇化的IGF-1變體(WO2009121759，WO2008025528和WO2006066891)。因為IGF-1具有差的藥物動力學性質(短的消除半衰期)，制備IGF變體的聚乙二醇化版本。制備IGF變體的聚乙二醇化版本用于治療神經肌肉病患在WO2008025528，WO2009121759A2和WO2006066891中描述。通常PEG連接于蛋白質的氨基。然而，這種氨基聚乙二醇化方法的主要限制是，蛋白質通常含有大量的賴氨酸殘基，因此，聚(乙二醇)基團以非特異性的方式連接于蛋白質。生物活性所需氨基殘基(例如蛋白質活性位點附近或活性位點上的殘基)的聚乙二醇化可以導致低的比活性或蛋白質的失活。為了避免上述的一些缺點，WO2006066891描述了使用由IGF-1變體和一個或兩個聚(乙二醇本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于制備聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物的方法，其中，在所述組合物中至少61％包含于所述組合物中的單聚乙二醇化治療性蛋白質級分是N?端單聚乙二醇化治療性蛋白質，所述方法包括在水性介質中使治療性蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原性烷基化條件下反應的步驟，其特征在于所述反應在pH范圍約6.5至7.5進行，以提供聚乙二醇化治療性蛋白質組合物。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.12.12 US 61/915,0901.一種用于制備聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物的方法，其中，在所述組合物中至少61％包含于所述組合物中的單聚乙二醇化治療性蛋白質級分是N-端單聚乙二醇化治療性蛋白質，所述方法包括在水性介質中使治療性蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原性烷基化條件下反應的步驟，其特征在于所述反應在pH范圍約6.5至7.5進行，以提供聚乙二醇化治療性蛋白質組合物。2.一種用于制備單聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物的方法，其中在所述組合物中至少65％包含在所述組合物中的單聚乙二醇化蛋白質級分是N-端單聚乙二醇化治療性蛋白質，所述方法包括步驟(a)在水性介質中使治療性蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原性烷基化條件下反應，其特征在于偶聯反應在pH范圍約6.5至7.5進行，(b)對在步驟(a)中獲得的組合物進行層析步驟，以提供單聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物。3.根據權利要求1-2任一項所述的制備組合物方法，其中所述治療性蛋白質是人IGF-1前體蛋白或其變體。4.根據前述權利要求任一項所述的方法，其特征在于在α環糊精(α-CD)存在下進行聚乙二醇化反應。5.根據前述權利要求任一項所述的方法，其特征在于PEG具有20至100kDa的總分子量。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于PEG具有約30kDa的總分子量。7.根據權利要求2-6所述的方法，其中交換層析步驟為陽離子交換層析(CEX)步驟，其包括合并含有N-端單聚乙二醇化治療性蛋白質的那些級分，以提供單聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物。8.根據權利要求7所述的方法，還包括以下附加的步驟b)超濾(UF)/滲濾(DF)濃縮和緩沖液交換，c)最后的過濾。9.根據權利要求3-8任一項所述的方法，其中IGF1前體蛋白是人IGF-1Ea肽前體蛋白，其中氨基酸E3缺失，氨基酸R37被丙氨酸取代和氨基酸R71和S72缺失，和其中氨基酸編號對應于SEQ ID NO：5。10.根據權利要求9所述的方法，其中IGF1前體蛋白是由SEQ ID NO：55組成的人IGF-1Ea肽前體蛋白。11.根據權利要求1、3-6、9和10的方法生產的組合物，其中在所述組合物中至少61％包含在所述組合物中的單聚乙二醇化治療性蛋白質級分是N-端單聚乙二醇化治療性蛋白質。12.根據權利要求2-10的方法生產的單聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物，其中在所述組合物中至少65％包含在所述組合物中的治療性蛋白質級分是N-端單聚乙二醇化治療性蛋白質。13.根據權利要求1、3-6、9和10的方法獲得的聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物，其中在所述組合物中至少61％包含在所述組合物中的單聚乙二醇化治療性蛋白質級分是N-端單聚乙二醇化治療性蛋白質。14.根據權利要求2-10的方法獲得的單聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物，其中在所述組合物中至少65％包含在所述組合物中的聚乙二醇化治療性蛋白質級分是N-端單聚乙二醇化治療性蛋白質。15.根據權利要求1、3-6、9和10的方法獲得的聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物，其中在所述組合物中至少61％包含在所述組合物中的單聚乙二醇化治療性蛋白質級分是N-端單聚乙二醇化治療性蛋白質。16.根據權利要求2-10的方法獲得的單聚乙二醇化治療性蛋白質的組合物，其中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：S·葉夫謝瓦爾，M·昆斯特爾，B·波多布尼克，
申請(專利權)人：諾華股份有限公司，斯洛文尼亞萊柯制藥股份有限公司，
類型：發明
國別省市：瑞士;CH