一種面包乳桿菌菌株及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種面包乳桿菌菌株及其應(yīng)用，所述的菌株面包乳桿菌(Lactobacillus?crustorum)，保藏編號(hào)為CGMCC?No.6304，本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還涉及將所述菌株用于茶籽粕的固態(tài)發(fā)酵脫毒的方法，具體步驟為：(1)斜面培養(yǎng)；(2)種子培養(yǎng)；(3)固態(tài)發(fā)酵；本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的有益效果是利用面包乳桿菌發(fā)酵的茶籽粕溶血作用明顯下降，降低了茶籽粕的毒性，從而彌補(bǔ)了茶籽粕在冷血?jiǎng)游镲暳蠎?yīng)用方面的不足。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

：本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種微生物菌株，特別涉及一種面包乳桿菌菌株及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
：皂苷的毒性主要表現(xiàn)為溶血性，一般認(rèn)為，溶血性是其苷元可以與紅細(xì)胞壁上膽甾醇結(jié)合生成不溶于水的復(fù)合物沉淀，破壞細(xì)胞滲透壓，使紅細(xì)胞發(fā)生崩解，進(jìn)而導(dǎo)致溶血現(xiàn)象。皂苷有無(wú)溶血活性與皂苷元有關(guān)，活性強(qiáng)弱與糖分子的大小、糖分子之間的連接、糖分子上的取代基等有關(guān)，此外還與皂苷的濃度有關(guān)。茶皂素的結(jié)構(gòu)如附圖1所示，屬于三萜類(lèi)皂苷，由糖體、配基和有機(jī)酸組成。從分子結(jié)構(gòu)看，茶皂素是一種非離子表面活性劑。其親水基團(tuán)是強(qiáng)電負(fù)性的含氧基團(tuán)組成，這些基團(tuán)集中在茶皂素的糖體配體，有機(jī)酸配體及皂苷配基的連接部位，構(gòu)成親水部分。其中配基是由非極性的碳?xì)洵h(huán)鏈構(gòu)成，在水溶液中呈現(xiàn)憎水的傾向，成為親油的主體，所以茶皂素的結(jié)構(gòu)分為親水和親油兩部分。Sobolewska等在發(fā)表于2010年9月(9卷，3期)《Phytochemistry?Review》(植物化學(xué)評(píng)論)425-474頁(yè)的《Saponins?as?cytotoxic?agents：a?review》(綜述：皂苷--細(xì)胞毒素)一文中稱(chēng)利用酶解法去除皂苷的糖體配體，會(huì)降低皂苷的溶血性。酶水解工業(yè)化應(yīng)用成本較高，如能利用微生物發(fā)酵來(lái)降低茶籽粕的毒性，將更有工業(yè)化應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
：本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種面包乳桿菌菌株，以及利用該菌株進(jìn)行茶籽粕固態(tài)發(fā)酵脫毒的方法，經(jīng)發(fā)酵脫毒后的茶籽粕溶血作用明顯下降，降低了茶籽粕的毒性。為解決上述問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：一種面包乳桿菌菌株，所述菌株的分類(lèi)命名為：面包乳桿菌(Lactobacillus?crustorum)，保藏編號(hào)為CGMCC?No.6304，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰兩路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2012年6月28日。所述面包乳桿菌菌株的16s?rDNA堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。本專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)了所述面包乳桿菌菌株的篩選和應(yīng)用于茶籽粕發(fā)酵脫毒的方法，包括以下步驟：1、種子培養(yǎng)：將所述面包乳桿菌菌株于MRS固體培養(yǎng)基上涂布，然后于37℃厭氧培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃培養(yǎng)24h，使菌液的OD600值達(dá)到0.8，備用，所述種子培養(yǎng)基成分為：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，纖維二糖20.0g，吐溫-801ml，檸檬酸三銨2.0g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O?0.2g，MnSO4·2H2O?0.05g，蒸餾水1000ml。2、茶籽粕9g，加入含葡萄糖1.5％(w/w)、半乳糖1.5％(w/w)和硫酸銨2％(w/w)的pH5.0的磷酸鹽緩沖溶液7.2ml，混合均勻后高壓滅菌備用，得到未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基。3、按接種量10％(菌液/茶籽粕，ml/g)將步驟1中經(jīng)種子培養(yǎng)后的所述面包乳桿菌菌株接種于步驟2所述未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中，固液比1∶0.8(w/v)，37℃發(fā)酵36h，得發(fā)酵的固體培養(yǎng)基。4、茶籽粕發(fā)酵脫毒：往步驟3中所述發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中加入50ml70％(v/v)乙醇，80℃振搖4h，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮至干，將所得產(chǎn)物稱(chēng)重并用生理鹽水配制成100μg/ml的茶皂素固形物溶液A，備用；往步驟2中所述未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中加入50ml?70％(v/v)乙醇，80℃振搖4h，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮至干，將所得產(chǎn)物稱(chēng)重并用生理鹽水配制成100μg/ml的茶皂素固形物溶液B，作為對(duì)照，備用。5、溶血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)酵效果：(1)取血：將肝素鈉和裝有生理鹽水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上；用75％(v/v)酒精對(duì)動(dòng)物的取血部位進(jìn)行消毒；用一次性注射器吸取少量的肝素鈉溶液，抗凝1ml血液不少于15IU肝素鈉；用注射器從動(dòng)物靜脈中取血后，去除針頭，將血慢慢推到裝有冰生理鹽水的試管中，制得血樣。(2)血樣處理：將所述血樣于4℃冷凍離心，300rmp/5min；離心后去除上清液，保留沉淀，再加入少量4℃生理鹽水，用移液槍輕吹，使血溶解；重復(fù)本步驟至所述血樣上清無(wú)色，然后用生理鹽水稀釋到2％(v/v)，得稀釋后的血樣。(3)溶血實(shí)驗(yàn)：分別取所述茶皂素固形物溶液A和B各40μl、60μl、80μl、100μl和120μl，分別用生理鹽水定容至500μl，再分別加入500μl所述稀釋后的血樣，37℃溶血1h，10000rpm離心5min，從各管中取上清液600μl，混勻后，于540nm測(cè)定OD，空白對(duì)照為500μl生理鹽水和500μl所述稀釋后的血樣的混合液。本專(zhuān)利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：利用面包乳桿菌發(fā)酵的茶籽粕溶血作用明顯下降，降低了茶籽粕的毒性，從而彌補(bǔ)了茶籽粕在冷血?jiǎng)游镲暳蠎?yīng)用方面的不足。附圖說(shuō)明：圖1為：茶皂素結(jié)構(gòu)圖：R1、R2：反(側(cè))白芷酸和醛酸；R1＝CHO，CH2OH，CH3；R2＝CHO，CH3。圖2為：發(fā)酵前后茶籽粕提取物的溶血效果。具體實(shí)施方式：實(shí)施例1：1.配制培養(yǎng)基：平板培養(yǎng)(MRS固體培養(yǎng)基)：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，葡萄糖20.0g，吐溫-801ml，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2.0g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O?0.2g，MnSO4·2H2O?0.05g，碳酸鈣10g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml。121℃滅菌，倒平板。種子培養(yǎng)：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，纖維二糖20.0g，吐溫-801ml，檸檬酸三銨2.0g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O?0.2g，MnSO4·2H2O?0.05g，蒸餾水1000ml。2.茶籽粕固態(tài)發(fā)酵：取100μL保藏號(hào)為CGMCC?No.6304的面包乳桿菌菌液，于MRS固體培養(yǎng)基上涂布，將涂布好的平板37℃厭氧培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃培養(yǎng)24h，使菌液的OD600值達(dá)到0.8，備用。取部分脫去茶皂素的茶籽粕(含2.3％(w/w)茶皂素)9g，加入7.2ml的pH5.0磷酸鹽緩沖溶液(添加葡萄糖1.5％(w/w)、半乳糖1.5％(w/w)、硫酸銨2％(w/w))。攪拌均勻后121℃，15min高壓滅菌，備用，得到未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基。在超凈臺(tái)中移取0.9m本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種面包乳桿菌菌株，其特征在于，所述菌株的保藏編號(hào)為CGMCCNo.6304。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種面包乳桿菌菌株，其特征在于，所述菌株的保藏編號(hào)為CGMCC
No.6304。
2.如權(quán)利要求1所述的面包乳桿菌菌株在茶籽粕發(fā)酵脫毒中的應(yīng)用。
3.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的面包乳桿菌菌株進(jìn)行茶籽粕發(fā)酵脫毒
的方法，包括以下具體步驟：
(1)種子培養(yǎng)：將所述面包乳桿菌菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)，使菌液的OD600值達(dá)到0.8，備用；
(2)按固液比1∶0.8(w/v)往茶籽粕中加入含葡萄糖1.5％(w/w)、半乳
糖1.5％(w/w)和硫酸銨2％(w/w)的pH5.0的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后
高壓滅菌備用，得到未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基；
(3)將經(jīng)種子培養(yǎng)后的所述面包乳桿菌菌株接種于(2)中所述未發(fā)
酵的固體培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵36h，得發(fā)酵的固體培養(yǎng)基；
(4)茶籽粕發(fā)酵脫毒：往(3)中所述發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張建華，尹麗茸，黃蓓，吳秉宇，李雙雙，林立，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：上海交通大學(xué)，福建天生農(nóng)業(yè)股份有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：