本發明專利技術公開了一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，屬于微生物發酵制藥領域。本方法將制備得到的多孔陶瓷用發酵液進行處理后干燥待用；將纖維堆囊菌分別經M26固體、液體培養基培養后，得到菌懸液；將菌懸液稀釋后接種于發酵液中，再向其中加入經處理過的多孔陶瓷，振蕩培養。本發明專利技術提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生產菌株的方法，在埃博霉素B發酵生產時，通過對其生產菌株纖維堆囊菌進行固定，這樣可以為在液體環境中生長的粘細菌細胞提供一個固體附著面，本方法能夠提高發酵產量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產成本，操作步驟簡單易行，可以放大至工業化生產，為埃博霉素的工業化生產奠定了實驗基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于纖維堆囊菌發酵
，涉及。
技術介紹
埃博霉素B (Epothilone B, EP0-906)是由纖維堆囊菌產生的一種已進入臨床抗腫瘤治療研究的藥物。目前埃博霉素的發酵產量很低，主要由兩個原因。第一是埃博霉素對其生產菌株有毒性抑制作用，這在很大程度上限制了埃博霉素的發酵產量。雖然可以利用大孔吸附樹脂XAD-16來解決這方面的困難，但樹脂對發酵液中其他物質的非特異性吸附也為埃博霉素產量的提高帶來新的困難。第二，纖維堆囊菌復雜的細胞行為。它們往往在固體培養基上能良好的生長、代謝并產生埃博霉素，但在液體培養基中生長時代謝行為往往會發生改變；如細胞·成團生長，并且內外細胞的狀態不一致；細胞存在自溶性現象；代謝狀態不穩定等。因此開發一種能夠作為埃博霉素生產菌株的固體化材料，并將其用于發酵液中將極大地增加埃博霉素的產量。多孔陶瓷作為一種新型陶瓷材料，一直倍受生物、環保領域科研人員的青睞，這是因為它作為生物催化劑的載體具有氣孔率高、化學穩定性好、比表面積大、體積密度小以及耐高溫、耐腐蝕等特點，另外多孔陶瓷還具備無毒害作用、穩定性優異、傳質性能好、機械強度高、生物親合性好、操作簡單、價廉易得等優點。
技術實現思路
本專利技術解決的問題在于提供，為纖維堆囊菌生產埃博霉素B提供生長代謝的固體附著面，從而提高發酵產量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產成本。為達到上述目的，本專利技術是通過以下技術方案來實現，包括以下步驟I)將纖維堆囊菌接種于M26固體培養基上培養，然后將培養得到的菌體接種于M26液體培養基中，振蕩培養；2)將經M26液體培養基培養后的液體，高速攪拌使菌體均勻打散后，離心收集沉淀，加入無菌水重懸得纖維堆囊菌到菌懸液；3)按IOOmL發酵液接種5 IOmg菌種的比例,將纖維堆囊菌菌懸液接種于發酵液中，然后加入菌種質量50 400倍經發酵液浸泡處理過的硅藻土基多孔陶瓷材料塊，在25 35°C，180 220rpm 搖床培養 72 96h。所述在溫度28 30°C，轉速180 200r/min下搖床培養72 96h。所述的纖維堆囊菌為纖維堆囊菌ATCC25532。所述在M26固體培養基上培養時其培養條件為30°C下，恒溫培養箱中培養72 96h ；所述在M26液體培養基上培養時其培養條件為30°C，200rpm搖床振蕩培養72 96h。步驟2)所述的高速攪拌時間為10 20min。步驟2)和步驟3)所述的離心過程是在4°C下,8000rpm,離心lOmin。所述的多孔陶瓷的孔徑在5 10 μ m,比表面積為40 50m2/g,能夠吸附固定粘細菌。所述的多孔陶瓷抗折強度為15 20MPa，吸水率達到50%。所述的多孔陶瓷的處理為多孔陶瓷塊經150°C高溫滅菌10 30min，自然冷卻后，加入發酵液完全覆蓋多孔陶瓷塊并高出10 50mm，常溫下搖晃O. 5 lh，靜置I 2h后傾去發酵液，100 105°C干燥后待用。所述的多孔陶瓷塊在發酵時懸浮在發酵液中。所述的IOOmL發酵液中多孔陶瓷塊的加入量為I 2g。與現有技術相比，本專利技術具有以下有益的技術效果本專利技術的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，在埃博霉素B發酵生產時，通過添加硅藻土基多孔陶瓷對生產菌株纖維堆囊菌提供附著物，幫助其在培養液中固定，這樣可以為在液體環境中生長的粘細菌細胞提供一個固體附著面，從一定程度上滿足粘細菌生長代謝產生埃博霉素的 固體培養微環境，克服游離發酵培養時成團成片生長所帶來的傳質不均勻、代謝不穩定等難題。進一步，本專利技術的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，埃博霉素生產菌株被硅藻土基多孔陶瓷固定，也有利于緩解埃博霉素對其生產菌株的反饋抑制作用，從而提高發酵產量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產成本，本專利技術的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，從所要固定的微生物菌體粘細菌聚集擴展的生長特點出發，所采用的硅藻土基多孔陶瓷的孔徑在5 10 μ m，抗折強度為15 20MPa，比表面積為40 50m2/g，吸水率達到50%，能夠良好的吸附固定粘細菌，吸附量達到了 10 15mg/g，并且在吸附固定粘細菌過程中磨損較少。本專利技術的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，簡單易行，可以進行工業化操作，為埃博霉素的工業化生產奠定了現實性基礎。具體實施例方式下面結合具體的實施例對本專利技術做進一步的詳細說明，所述是對本專利技術的解釋而不是限定。本專利技術提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生產菌株的方法，從所要固定的微生物菌體粘細菌聚集擴展的生長特點出發，選擇合適的硅藻土基多孔陶瓷，孔徑在5 10 μ m，抗折強度為15 20MPa，比表面積為40 50m2/g，吸水率達到50%。進一步，給出以下制備方法I)稱取過60目篩的生娃藻土 40g,煅燒娃藻土 35g,粘土 15g,混合后加入20g水，在球磨機中球磨30min，將得到的漿液倒入搪瓷盤中，于105°C下干燥過夜。2)將干燥后的料漿研磨后過40目篩，再加入過80目篩的木屑lg，石蠟Ig進行混合后過40目篩3次,使其混合均勻；緩慢噴灑2g水后過3次40目篩，進行整粒，裝入密封袋密封靜置3h。3)將經整粒的混合粉料用粉末壓片機在5MPa下壓制尺寸為Φ 10X 20mm樣品；4)將成型后的樣品在300 C干媒3h后，放入電阻爐中1000 C保溫30min使造孔劑(木屑和石蠟)揮發，得到硅藻土基多孔陶瓷。基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌的埃博霉素B的發酵生產方法，包括以下步驟1.多孔陶瓷的前處理將尺寸為Φ20 X IOmm的硅藻土基多孔陶瓷塊于150°C高溫滅菌30min，自然冷卻。將維堆囊菌發酵用發酵液加到多孔陶瓷樣品中，完全覆蓋樣品后高出約50_，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發酵液，多孔陶瓷干燥待用。2.菌懸液制備將一環新鮮的纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)接種于M26固體培養基上，30°C恒溫培養箱中培養72 96h ;將培養后的菌體接入IOOmL的M26液體培養基中，30°C，200rpm搖床培養72 96h ;培養結束后倒棄一部分液體，將剩余的液體轉移至含有攪拌子和玻璃珠的三角瓶中，磁力攪拌器上高速攪拌10 20min，使菌團打散打勻為止，離心收集打勻的菌體，重懸于30 50mL的無菌水中，形成菌懸液。用無菌水將菌懸液稀釋10 20倍后，離心收集沉淀，沉淀烘干后稱干重，可得菌懸液稀釋后的濃度，再換算成原來菌懸液的濃度，單位為mg/mL。在進行下一步發酵培養時可以按照一定的接種量來量取菌懸液，防止接種量過大而引起的傳質不良或溶氧不足等現象的發生。3.發酵培養按IOOmL接種5 IOmg菌種的比例,將纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)菌懸液接種于發酵液中，然后加入菌種質量50 400倍預處理過的多孔陶瓷，在25 35°C，180 220rpm搖床培養72 96h。以上所用到的菌種、培養基具體為所述的菌種為纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)即可,具體的可選用纖維堆囊菌ATCC25532。M26固體培養基成分為瓊脂20g/L，土豆淀粉8. 0g/L，大豆蛋白胨2. 0g/L，葡萄糖2. 0g/L，酵母粉 2. 0g/L,本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，其特征在于，包括以下步驟：1）將纖維堆囊菌接種于M26固體培養基上培養，然后將培養得到的菌體接種于M26液體培養基中，振蕩培養；2）將經M26液體培養基培養后的液體，高速攪拌使菌體均勻打散后，離心收集沉淀，加入無菌水重懸得纖維堆囊菌到菌懸液；3）按100mL發酵液接種5～10mg菌種的比例，將纖維堆囊菌菌懸液接種于發酵液中，然后加入菌種質量50～400倍經發酵液浸泡處理過的硅藻土基多孔陶瓷材料塊，在溫度25～35℃，180～250r/min搖床培養72～96h。
【技術特征摘要】
1.一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將纖維堆囊菌接種于M26固體培養基上培養，然后將培養得到的菌體接種于M26液體培養基中，振蕩培養； 2)將經M26液體培養基培養后的液體，高速攪拌使菌體均勻打散后，離心收集沉淀，力口入無菌水重懸得纖維堆囊菌到菌懸液； 3)按IOOmL發酵液接種5 IOmg菌種的比例,將纖維堆囊菌菌懸液接種于發酵液中，然后加入菌種質量50 400倍經發酵液浸泡處理過的硅藻土基多孔陶瓷材料塊，在溫度25 35°C，180 250r/min 搖床培養 72 96h。2.根據權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，其特征在于，所述在溫度28 30°C，轉速180 200r/min下搖床培養72 96h。3.根據權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，其特征在于，所述的纖維堆囊菌為纖維堆囊菌ATCC25532。4.根據權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發酵的方法，其特征在于，所述在M26固體培養基上培養時其培養條件為30°C下，恒溫培養箱中培養72 96h ； 所述在M26液體培養基上培養時其培養條件為30°C，200rpm搖床振蕩培養72 96h。5.根據權利要求1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：龔國利，劉麗麗，王娜，
申請(專利權)人：陜西科技大學，
類型：發明
國別省市：
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