一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒含有：a）DNA提取液、b)引物、c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、d)SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于：從細(xì)胞樣品中提取DNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)引入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，引物序列分別為正義引物：5’-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC-3’，反義引物：5’-CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA-3’，擴(kuò)增子大小為170bp，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA連接蛋白編碼區(qū)170bp的pTA2載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A260定量并10倍梯度稀釋。結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測(cè)范圍廣。也可以進(jìn)行鼠腺病毒引起的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，更具體涉及一種檢測(cè)鼠腺病毒的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，同時(shí)還涉及SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的應(yīng)用，該SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒可高效方便的對(duì)各種生物材料的小鼠源腺病毒進(jìn)行定量檢測(cè)和質(zhì)量監(jiān)控，也可以進(jìn)行鼠腺病毒的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。
技術(shù)介紹
鼠腺病毒(Murineadenovirusl, MAdV-1)屬腺病毒科(Adenoviridae)哺乳動(dòng)物屬(Mastad enovirus)。腺病毒無(wú)囊膜，病毒粒子為二十面體，直徑為80 IlOnm,由252個(gè)殼粒組成。一般感染哺乳動(dòng)物的腺病毒相對(duì)分子質(zhì)量為20 25X 106，G+C含量為48% 61%。腺病毒分布十分廣泛，一般對(duì) 于人體沒(méi)有致癌性，但是腺病毒容易導(dǎo)致呼吸道感染，如急性發(fā)熱性咽喉炎、咽結(jié)膜熱和肺炎等。鼠腺病毒可損害人類心血管組織，被懷疑為人類心臟損害的一種病原。因此，對(duì)小鼠慢性持續(xù)性鼠腺病毒感染診斷，對(duì)控制鼠腺病毒蔓延、防治具有積極意義。目前檢測(cè)技術(shù)一般來(lái)說(shuō)有血清學(xué)診斷技術(shù)、生物學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三類:1、血清學(xué)診斷技術(shù)包括免疫熒光技術(shù)(IFA)、雙抗體夾心ELISA檢測(cè)等。但由于所有實(shí)驗(yàn)均用到抗血清和抗原免疫反應(yīng)，所以反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、材料多、準(zhǔn)備周期長(zhǎng)，而且檢測(cè)具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復(fù)性差。2、生物學(xué)試驗(yàn)包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)。這種檢測(cè)方法存在不敏感問(wèn)題，而且有些樣品存在抗補(bǔ)體活性，影響檢測(cè)效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本較高、檢測(cè)周期長(zhǎng)，耗費(fèi)大量生物資源和人力物力。3、分子生物學(xué)診斷技術(shù)，即應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)鼠腺病毒持續(xù)感染。相比之下，PCR方法特異性好，檢測(cè)靈敏度高，不但可以檢測(cè)活病毒核酸，也能直接檢測(cè)滅活的核算片段。但普通的PCR檢測(cè)方法測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始的DNA或RNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以無(wú)法定量起始的DNA或RNA拷貝數(shù)。近年發(fā)展起來(lái)的突光定量PCR技術(shù)(Fluorogenetic Quantitative PCR, FQ-PCR)有靈敏度高、速度快、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。目前使用比較多的是SYBR Green I熒光染料法和Taqman法。兩種方法都具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。在基因表達(dá)水平分析(N ellemann C, Vinggaard AM, Dalagaard M, et al.Quantification of AntiandrogenEffect Det ermined by Light Cycler Technology[J].Toxicology, 2001，163:29-38)、病原體的定性(Bhu devi B, Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan)for Detection and Classificatio n of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol., 2001, 83:1-10.)和定量檢測(cè)(Kathy F.J.Tang, Jun Wang, DonaldV.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR witha TaqMan assay[J].J.Virol.Methods, 115(2004) 109-114.;Birgit Liss.1m provedquantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucle ic Acids Res. , 2002, Vol. 30No. 17e89. Florence KP, Glaucia PB, Mireille S, etal. Quantit ation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J]. J. Virol.Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已成為當(dāng)前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比較多的熒光定量PCR方法有SYBR Green I熒光染料法和TaqMan法，這兩種方法都具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)所采用的基于SYBR GreenI熒光染料技術(shù)的熒光定量PCR檢測(cè)方法其引物設(shè)計(jì)、合成更加簡(jiǎn)便。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是在于提供了一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用于目前市場(chǎng)上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀，結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測(cè)范圍廣。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是在于提供了一種鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒在檢測(cè)(抗)鼠腺病毒藥物研究中的應(yīng)用，可對(duì)小鼠、大鼠細(xì)胞制品進(jìn)行定量檢測(cè)和質(zhì)量監(jiān)控，也可以進(jìn)行鼠腺病毒引起的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)措施一種檢測(cè)鼠腺病毒的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有a)DNA提取液、b)引物、c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、d) SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于從細(xì)胞樣品中提取DNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)引入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，定量檢測(cè)未知樣品。引物序列分別為正義引物5’-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC-3’，反義弓 I 物5 ’ -CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA-3 ’，擴(kuò)增子大小為170bp。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒核心DNA連接蛋白編碼`區(qū)170bp的pTA2載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5ci為最常用于常規(guī)克隆應(yīng)用的大腸桿菌菌株。除支持藍(lán)/白篩選外,DH5 α的recAl和endAl突變可增強(qiáng)嵌入穩(wěn)定性并提高自minipreps制備的質(zhì)粒DNA質(zhì)量)，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量并10倍梯度稀釋。所述的DNA 提取液是由 5mL100mM Tris-HCl (ρΗ=8· 5)、0· 5mL0. 5M EDTA,lmL10%SDS、2mL5M NaCl、0. 25mL0. 2mg/mL 蛋白酶 K 和 41. 25mL 滅菌的雙蒸水組成。所述的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液是由2XiTaq SYBR Green Supermix (with R0X)、10 μ M的正義引物和反義引物和滅菌的雙蒸水組成。所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板核苷酸序列為Ataagaaaggatgcggaaaaggaccgcatcgttgaagacataacaaattagtaaaaggtacaacataggatgtaaaatagccaatga ccatatgatcaccgcgcggacatgccgctcggagggttttgtgagctttttgcagaactttactctgttgcttctg本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有：a）DNA提取液、b)引物、c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、d)?SYBR?Green?I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于：從細(xì)胞樣品中提取DNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)引入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，引物序列分別為正義引物：5’?ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC??3’，反義引物：5’?CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA??3’，擴(kuò)增子大小為170bp，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA連接蛋白編碼區(qū)170bp的pTA2載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A260定量并10倍梯度稀釋。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有:a) DNA提取液、b)引物、c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、d) SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于:從細(xì)胞樣品中提取DNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)引入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，引物序列分別為正義引物:5，-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC _3 ’，反義引物:5 ’ -CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA _3 ’，擴(kuò)增子大小為170bp，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA連接蛋白編碼區(qū)170bp的pTA2載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量并10倍梯度稀釋。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的 DNA 提取液是由 5mL IOOmM Tris_HClpH=8.5、0.5mL 0.5M EDTAUmL 10%SDS、2mL5MNaCl>0....

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：肖庚富，張哲，鄭從義，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：武漢珈創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：