本發明專利技術公開了一種檢測小鼠痘病毒的熒光定量PCR試劑盒及應用，該試劑盒含有：a)DNA提取液、b)引物、c)標準陽性模板、d)SYBRGreenI實時熒光定量PCR反應液，從細胞樣品中提取DNA，進行熒光定量PCR反應，同時引入標準陽性模板，引物序列分別為正義引物：5’-GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT-3’，反義引物：5’-ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA-3’，擴增子大小為176bp，標準陽性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA連接蛋白編碼區176bp的pTA2載體轉化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質粒，并于紫外分光光度計測A260定量并10倍梯度稀釋。結果更加準確、可靠，重復性好。靈敏度高、定量快速準確、檢測范圍廣、穩定性好。也可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，更具體涉及一種檢測小鼠痘病毒的SYBR Green I實時熒光定量PCR試劑盒，同時還涉及SYBR Green I實時熒光定量PCR試劑盒的應用，該SYBRGreen I實時熒光定量PCR試劑盒可高效方便的對小鼠細胞制品進行定量檢測和質量監控，也可以進行小鼠痘病毒的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。
技術介紹
小鼠痘病毒(Ectromelia virus, ECTV)屬痘病毒科(Poxviridae)脊椎動物痘病毒亞科(Chor dopoxvirinae)正痘病毒屬(Orthpoxvirus),是一種單一分子雙鏈DNA病毒，病毒粒子為磚形，大小為200nmX200nmX250nm，對乙醚抗性。其基因組序列與天花病毒有很大的相似性，因此《中華人民共和國藥典》規定對鼠源性生物制品必須檢測小鼠痘病毒。小鼠痘病毒感染有急性和慢性兩種形式，常見實驗室烈性傳染性脫腳病就是由小鼠痘病毒急性感染引起，臨床表現為四肢、尾和頭部腫脹、潰爛、壞死甚至腳趾脫落為特征。慢性感染中主要為持續性感染，小鼠痘病毒慢性持續性感染小鼠沒有明顯臨床癥狀，是誘發脫腳病或產生病毒傳染的主要因素。因此，對實驗小鼠慢性持續性小鼠痘病毒感染診斷，對控制小鼠痘病毒蔓延、防止脫腳病發生具有積極意義。目前檢測技術一般來說有血清學診斷技術、生物學試驗、分子生物學診斷技術三類I、血清學診斷技術包括免疫熒光技術(IFA)、雙抗體夾心ELISA檢測等。但由于所有實驗均用到抗血清和抗原免疫反應，所以反應時間長、材料多、準備周期長，而且檢測具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復性差。2、生物學試驗包括動物實驗、雞胚接種和細胞培養。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品存在抗補體活性，影響檢測效果。動物實驗成本較高、檢測周期長，耗費大量生物資源和人力物力。`3、分子生物學診斷技術，即應用PCR技術檢測小鼠痘病毒持續感染。PCR方法特異性好，檢測靈敏度高，不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核酸片段。在上世紀90年代，國內就有報道使用PCR技術建立檢測小鼠痘病毒的方法，最低檢出小鼠痘病毒DNA量為O. Ipgo由于PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以該方法無法定量起始的DNA或RNA拷貝數。近年發展起來的熒光定量PCR(FluorogeneticQuantitative PCR, FQ-PCR)技術有靈敏度高、速度快、特異性好等優點。在基因表達水平分析(Nellema nn C, Vinggaard AM, Dalagaard M, et al. Quantification of AntiandrogenEffect Determin ed by Light Cycler Technology[J] · Toxicology, 2001，163:29-38)、病原體的定性(Bhudevi B, Weinstock D. Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J]. Vet.Microbiol. , 2001, 83:1-10.)和定量檢測(Kathy F. J. Tan g, Jun Wang, DonaldV.Lightner. Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-P CR witha TaqMan assay[J].J.Virol.Methods, 115(2004) 109-114.;Birgit Liss.1mprove dquantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucleic Ac ids Res., 2002, Vol.30N0.17e89.Florence KP, Glaucia PB, Mireille S,etal.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到廣泛應用，并且已成為當前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比較多的熒光定量PCR方法有SYBR Green I熒光染料法和TaqMan法，這兩種方法都具有靈敏度高、檢測速度快、特異性好的優點。M.SofiIbrahim等(2003)使用基于TaqMan探針的real-time PCR法檢測天花病毒,最低檢測濃度能達到Ifg/ μ L(25copies),比普通PCR方法靈敏100倍。Luo A-dong等(2008)使用SYBR Green I熒光染料建立山羊痘病毒熒光定量PCR檢測方法，最低能檢測700COpieS DNA樣品。SYBR Green I熒光染料法和TaqMan探針法在靈敏度上相差不大。目前，國內已有基于TaqMan探針技術的real-timePCR檢測小鼠痘病毒的專利方法，“用于檢測小鼠脫腳病病毒的引物、探針及其方法(申請公布號CN102329889A)”。本專利技術所采用的基于SYBR Green I熒光染料技術的熒光定量PCR檢測方法其引物設計、合成更加簡便。
技術實現思路
本專利技術的目的是在于提供了一種檢測小鼠痘病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用于目前市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，結果更加準確、可靠，重復性好。靈敏度高、定量快速準確、檢測范圍廣、穩定性好。本專利技術的另一個目的是在于提供了一種熒光定量PCR試劑盒在檢測(抗)小鼠痘病毒藥物研究中的應用，可對小鼠、大鼠細胞制品進行定量檢測和質量監控，也可以進行小鼠痘病毒引起的烈性傳染性脫腳病的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。為了實現上述目的，本專利技術采用以下技術措施:一種檢測小鼠痘病毒的SYBR Green I實時熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有:a) DNA提取液、b)引物、c)標準陽性模板、d) SYBR Green I實時熒光定量PCR反應液，其特征在于:從細胞樣品中提取DNA，進行熒光定量PCR反應，同時引入標準陽性模板，定量檢測未知樣品。引物序列分別為正義引物:5 ’ -GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT-3 ’，反義引物:5’ -ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA-3’，擴增子大小為176bp。標準陽性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA連接蛋白編碼區176bp的pTA2 (購自Τ0Υ0Β0公司)載體轉化大腸桿菌DH5ci (本實驗室保存，大腸桿菌DH5ci為最常用于常規克隆應用的大腸桿菌菌株。除支持藍/白篩選外，DH5 α的recAl和endAl突變可增強嵌入穩定性并提高自minipreps制備的質粒DNA質量)，增殖后提取質粒，并于紫外分光光度計測A26tl定量并10倍梯度稀釋。所述的DNA 提取液是由 5mL100mM Tris-HCl (ρΗ=8本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測小鼠痘病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有：a)DNA提取液、b)引物、c)標準陽性模板、d)?SYBR?Green?I實時熒光定量PCR反應液，其特征在于：從細胞樣品中提取DNA，進行熒光定量PCR反應，同時引入標準陽性模板，引物序列分別為正義引物：5’?GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT?3’，反義引物：5’?ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA?3’，擴增子大小為176bp，標準陽性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA連接蛋白編碼區176bp的pTA2載體轉化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質粒，并于紫外分光光度計測A260定量并10倍梯度稀釋。
【技術特征摘要】
1.一種檢測小鼠痘病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有:a)DNA提取液、b)引物、c)標準陽性模板、d) SYBR Green I實時熒光定量PCR反應液，其特征在于:從細胞樣品中提取DNA，進行熒光定量PCR反應，同時引入標準陽性模板，引物序列分別為正義引物:5’ -GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT-3’，反義引物:5’ -ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA-3’，擴增子大小為176bp，標準陽性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA連接蛋白編碼區176bp的pTA2載體轉化大腸桿菌DH5 α，增殖后提取質粒，并于紫外分光光度計測A26tl定量并10倍梯度稀釋。2.根據權利要求1所述的一種檢測小鼠痘病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的 DNA 提取液是由 5mL IOOmM Tris_HClpH=8.5、0.5mL 0.5M EDTAUmL 10%SDS、2mL5MNaCl>0.25mL ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：肖庚富，張哲，鄭從義，
申請(專利權)人：武漢珈創生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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