本發明專利技術公開了一種檢測仙臺病毒的熒光定量PCR試劑盒及應用，該試劑盒含有：a)RNA提取液、b)逆轉錄酶反應液、c)逆轉錄酶、d)RNA酶抑制劑、e)引物、f)標準陽性DNA模板、g)SYBRGreenI實時熒光定量PCR反應液，其特征在于：引物序列分別為正義引物：5’-ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT-3’，反義引物：5’-CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3’，擴增子大小為142bp，標準陽性DNA模板由已插入仙臺病毒保守的NP蛋白編碼區142bp的pTA2載體轉化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質粒，并于紫外分光光度計測A260定量并10倍梯度稀釋。結果更加準確、可靠、穩定性好、重復性好，靈敏度高、定量快速準確、檢測范圍廣。也可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，更具體涉及一種檢測仙臺病毒的SYBR Green I實時熒光定量PCR試劑盒，同時還涉及SYBR Green I實時熒光定量PCR試劑盒的應用，該SYBR Green I實時熒光定量PCR試劑盒可高效方便的對小鼠細胞制品進行定量檢測和質量監控，也可以進行仙臺病毒的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。
技術介紹
仙臺病毒(Sendai virus, SeV)屬副粘病毒科副粘病毒亞科、呼吸道病毒屬病毒，呈多形性，主要為球形，直徑約200 μ m。SeV是一種單股負鏈RNA病毒，基因組大小為15kb。SeV是引起嚙齒類動物呼吸系統疾病的主要病原，可影響幼鼠發育成長和降低成年鼠的繁殖率，且很難從鼠群中清除。SeV甚至可感染靈長類動物及人類，它主要引起嬰幼兒下呼吸道嚴重疾病及較大兒童的上呼吸道感染，以發熱、咳嗽、氣喘或胸悶胸痛為主，甚至造成致死性感染。但對較大兒童和成人一般只引起普通感冒癥狀的上呼吸道感染，很少導致感染死亡。SeV廣泛分布于世界各地，其流行或散發常與流感病毒伴發流行。因此《中華人民共和國藥典》規定對鼠源性生物制品必須檢測仙臺病毒。診斷實驗小鼠的仙臺病毒感染和控制其蔓延都具有積極意義。目前的檢測技術一般來說有血清學診斷技術、生物學試驗、分子生物學診斷技術三類I、血清學診斷技術包括免疫熒光技術(IFA)、雙抗體夾心ELISA檢測等。但由于所有實驗均用到抗血清和抗原免疫反應，所以反應時間長、材料多、準備周期長，而且檢測具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復性差。2、生物學試驗包括動物實驗、雞胚接種和細胞培養。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品存在抗補體活性，影響檢測效果。動物實驗成本較高、檢測周期長，耗費大量生物資源和人力物力。`3、分子生物學診斷技術，即應用普通RT-PCR技術檢測仙臺病毒(YukiharuH, Kiyoka ke T，Michisato K，et al. Detection of nucleoprotein gene of Sendai virusin the lungs of rats by touchdown nested reverse transcription polymerasechain reaction [J]. Experimental Animals, 1997，46 (4)，307-310) 普通 RT-PCR 方法特異性好，檢測靈敏度較高，解決了血清學方法無法對無血清生物制品和免疫缺陷小鼠進行檢測的缺點。但是由于普通RT-PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以該方法無法定量起始的DNA或RNA拷貝數。近年發展起來的熒光定量PCR(FluOTOgeneticQuantitative PCR，FQ-PCR)技術具有靈敏度高、速度快、特異性好等優點。在基因表達水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM, Dalagaard Mj et al. Quantification of AntiandrogenEffect Determined by Light Cycler Tec hnology[J] · Toxicology，2001，163:29-38)、病原體的定性(Bhudevi Bj Weinstock D.Fluoro genic RT-PCR assay (TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea V irus [J].Vet.Microbiol., 2001, 83:1-10.)和定量檢測(Kathy F.J.Tang, Jun Wang, DonaldV.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR witha TaqMan assa y[J].J.Virol.Methods, 115(2004) 109-114.;Birgit Liss.1mprovedquantitative real-time R T-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucleic Acids Res., 2002, Vol.30N 0.17e89.Florence KP, Glaucia PB, Mireille S, etal.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到廣泛應用，并且已成為當前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比較多的熒光定量PCR方法有SYBR Green I熒光染料法和TaqMan法，這兩種方法都具有靈敏度高、檢測速度快、特異性好的優點。本專利技術所采用的基于SYBR GreenI熒光染料技術的熒光定量PCR檢測方法其引物設計、合成更加簡便，且具有良好的重復性和靈敏度。
技術實現思路
本專利技術的目的是在于提供了一種檢測仙臺病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用于目前市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，結果更加準確、可靠、穩定性好、重復性好，靈敏度高、定量快速準確、檢測范圍廣。本專利技術的另一個目的是在于提供了一種仙臺病毒的熒光定量PCR試劑盒在檢測(抗)仙臺病毒藥物研究中的應用，可對小鼠、大鼠細胞制品進行定量檢測和質量監控，也可以進行仙臺病毒引起的嬰幼兒下呼吸道嚴重疾病及較大兒童的上呼吸道感染的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。為了實現上述目的，本專利技術采用以下技術措施:一種檢測仙臺病毒的SYBR Green I實時熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有:a)RNA提取液、b)逆轉錄酶反應液、c)逆轉錄酶、d)RNA酶抑制劑、e)引物、f)標準陽性DNA模板、g)SYBR Green I實時熒光定量PCR反應液，其特征在于:引物序列分別為正義引物:5，-ACCTATGGTCAACAAG AGTCCGCT-3，，反義引物:5’ -CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3，，擴增子大小為142bp，標準陽性DNA模板由已插入仙臺病毒保守的NP蛋白編碼區142bp的pTA2載體(購自Τ0Υ0Β0)轉化大腸桿菌DH5a (本實驗室保存，大腸桿菌DH5 a為最常用于常規克隆應用的大腸桿菌菌株。除支持藍/白篩選外，DH5 a的recAl和endAl突變可增強嵌入穩定性并提高自minipreps制備的質粒DNA質量),增殖后提取質粒,并于紫外分光光度計測A26tl定量并10倍梯度稀釋。所述的RNA提取液是由細胞裂解液(Trizol,購自Invitrogen)、氯仿、異丙醇、75%(質量體積比，下同)乙醇、滅菌的雙蒸水組成。所述的SYBR Green I實時熒光定量PCR反應液是由2X iTaq SYBR GreenSupermix (with R0X) >10 μ M的正義引物和反義引物和滅菌的雙蒸水組成。所述的標準陽性DNA本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測仙臺病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有：a)RNA提取液、b)逆轉錄酶反應液、c)逆轉錄酶、d)?RNA酶抑制劑、e)?引物、f)?標準陽性DNA模板、g)?SYBR?Green?I實時熒光定量PCR反應液，其特征在于：引物序列分別為正義引物：5’?ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT?3’，反義引物：5’?CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT?3’，擴增子大小為142bp，標準陽性DNA模板由已插入仙臺病毒保守的NP蛋白編碼區142bp的pTA2載體轉化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質粒，并于紫外分光光度計測A260定量并10倍梯度稀釋。
【技術特征摘要】
1.一種檢測仙臺病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有:a)RNA提取液、b)逆轉錄酶反應液、c)逆轉錄酶、d) RNA酶抑制劑、e)引物、f)標準陽性DNA模板、g) SYBR Green I實時熒光定量PCR反應液，其特征在于:引物序列分別為正義引物:5’ -ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT-3’，反義引物:5’ -CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3’，擴增子大小為142bp，標準陽性DNA模板由已插入仙臺病毒保守的NP蛋白編碼區142bp的pTA2載體轉化大腸桿菌DH5 α，增殖后提取質粒，并于紫外分光光度計測A26tl定量并10倍梯度稀釋。2.根據權利要求1所述的一種檢測仙臺病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的RNA酶抑制劑提取液是由細胞裂解液、氯仿、異丙醇、75%質量體積比乙醇、滅菌...
【專利技術屬性】
技術研發人員：肖庚富，張哲，鄭從義，
申請(專利權)人：武漢珈創生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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