本發(fā)明專利技術(shù)公開一種用于檢測山羊痘病毒的試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒中至少包括有SEQ№1、SEQ№2、SEQ№3和SEQ№4四條引物，試劑盒內(nèi)還有dNTP、Tris-HC、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween20和Bst酶，以及模板DNA。本發(fā)明專利技術(shù)的引物具有特異性，在同等條件下不能擴增綿羊痘病毒的核酸，同時本發(fā)明專利技術(shù)的檢測靈敏度較高，同時具有檢測操作相對簡單的、快速的優(yōu)點。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種獸醫(yī)學的檢測試劑盒，確切講是一種用于用于檢測山羊痘病毒的試劑盒。
技術(shù)介紹
羊痘(Capripox，CP)包括綿羊痘、山羊痘和牛的皮膚疙瘩病，其中前兩者是由綿羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)分別引起綿羊和山羊發(fā)生的接觸性傳染病。病畜體溫升高，全身出現(xiàn)丘疹或結(jié)節(jié)、水皰、內(nèi)臟病變甚至死亡，給世界養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其規(guī)定為法定必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病。綿羊痘和山羊痘的鑒別診斷一直是研究的熱點。綿羊痘和山羊痘的鑒別診斷一直是研究的熱點。研究表明，SPPV和GTPV基因序列同源性達到96%-97%，僅在基因組末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差異，見:Tulman, E.R., Afonso, C.L., Lu, Z., Zsak, L., Sur, J.H.,Sandybaevj N.T.，Kerembekovaj U.Z.，Zaitsev, V.L，Kutishj G.F.，Rock, D.L，2002.The genomes of sheeppox and goatpox viruses.J Virol.76， 6054-6061.。一般來說，SPPV、GTPV具有較嚴格的宿主嗜性，但有一些研究表明試這兩種病毒也可發(fā)生宿主嗜性改變，引起交叉感染，見:M.G.Garner, S.D.Sawarkar, E.K.Brett, J.R.Edwards, V.B.Kulkarni, D.B.Boyle;S.N.th e Extent and Impact of Sheep Poxand Goat Pox in the State of Maharashtra, India , Tropical Animal Health andProduction.2000，32(4):205-223.，繼而可能導致錯誤的臨床診斷和獲得不準確的流行病學信息，不利于對該病的有效防控。對羊痘病毒分離株進行準確的種屬鑒別有助于解決生產(chǎn)中遇到的這個問題，但SPPV和GTPV之間抗原性具有明顯交叉，用血清學方法很難區(qū)別開來，需通過分子生物學方法進行鑒別，見:Sheeppox and goatpox virus.World Organisation for Animal Health (2009).- Terrestrial Animal Health Code.0ΙΕ, Paris.。準確鑒定分離株種屬和弄清其來源將有助于羊痘的流行病學分析，具有重要意義。目前為止，基于基因序列分析的分子生物學鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒的方法并不十分成熟，前期專利技術(shù)人的實驗室通過克隆結(jié)合酶切的方法分析P32基因和GPCR基因建立了 PCR-RFLP方法，見:顏新敏，吳國華，李健等.山羊痘病毒感染綿羊的診斷及其基因的分子分析.中國獸醫(yī)科學，2011，41 (01): 14.，但是該方法需要專用的PCR儀器和酶切操作，相對來說比較繁瑣且費用較多，不利于生產(chǎn)實踐中的實際應用。而國內(nèi)肖雯等建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR方法擴增靈敏度僅為1.71X106 copies/μ L的GTPV基因組模板，且同樣需要專門的PCR儀器，因此該方法在生產(chǎn)實踐中也存在這局限性，見:肖雯，聶福平，王昱等.綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR檢測方法的建立及應用.中國預防獸醫(yī)學報.2012，7(7):551-554.。康文玉等建立了可檢測羊痘病毒屬的實時定量PCR方法，該方法以PCR為靶基因設(shè)計引物和探針進行綿羊痘病毒和山羊痘病毒的檢測，見康文玉，徐自忠，花群義等.羊痘病毒實時熒光定量TaqMan PCR檢測方法的建立.中國獸醫(yī)科學，2006.36(07):529-533.。程振濤、姚俊等也分別基于山羊痘病毒基因組不同的基因片段建立了檢測山羊痘病毒的實時定量PCR，見:程振濤，岳筠，李永明等.山羊痘病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法的建立與應用.生物工程學報，2009，25; 25 (3):464-47.姚俊，永軍，彭海生等.山羊痘病毒SYBR Green I實時定量PCR檢測方法的建立，動物醫(yī)學進展，2012，33(7):32-39.。但是以上方法均需要專用的價格昂貴的熒光定量PCR儀，而且對操作者要求相對較高，因此在實際生產(chǎn)中還是有一定的局限。環(huán)等溫介導技術(shù)(loopmediated isothermal amplication, LAMP)由于其具有快速、簡便、無需特殊儀器等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于各種疾病病原的檢測中。盡管國內(nèi)外均已有人針對羊痘病毒屬基因設(shè)計并建立了能夠檢測羊痘病毒屬的Lamp方法，如美國科學家Amaresh Das等人建立了靈敏度比較高的Lamp方法，見:Amaresh Das,Shawn Babiuk, and Michael T.McIntosh.Development of a Loop-Mediated IsothermalAmplification Assay for Rapid Detection of Capripoxviruses.Journal of ClinicalMicrobiology.2012, 1613
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供一種用于檢測山羊痘病毒的試劑盒。本專利技術(shù)的用于檢測山羊痘病毒的試劑盒中至少包括有四條引物，分別是SEQIDNa USEQ ID Na 2, SEQ ID Ns 3和SEQ ID Ns 4，所涉及的序列見序列表及后敘內(nèi)容。為方便使用，在本專利技術(shù)的用于檢測山羊痘病毒的試劑盒內(nèi)還可放置有dNTP、Tris-HC、KCl、(NH4) 2S04、MgS04、Tween 20 和 Bst 酶，以及模板 DNA。本專利技術(shù)是一種用于檢測山羊痘病毒的LAMP檢測試劑盒，其相應的檢測是應用特定的引物進行LAMP擴增，環(huán)等溫介導技術(shù)(loop mediated isothermal amplication,LAMP)具有快速、簡便、無需特殊儀器等優(yōu)點。采用本專利技術(shù)試劑盒內(nèi)的引物可以特異性擴增山羊痘病毒核酸，在進行檢測時可以對被檢樣品進行擴增，然后根據(jù)擴增產(chǎn)物的核酸電泳檢測到是否有特異性條帶確定被檢樣品是否帶有山羊痘病毒。本專利技術(shù)的引物具有特異性，在同等條件下不能擴增綿羊痘病毒的核酸，同時本專利技術(shù)的檢測靈敏度較高，同時具有檢測操作相對簡單、快速的優(yōu)點，可在羊痘病毒流行病學研究中應用及疾病的防控中應用。本專利技術(shù)中設(shè)計選取山羊痘病毒基因組的反向末端重復序列ITR區(qū)為靶基因，專門設(shè)計了只能匹配山羊痘病毒而不能匹配山綿羊痘病毒的特異性Lamp引物。本專利技術(shù)的試劑盒能夠檢測山羊痘病毒的試劑盒能夠快捷高效靈敏的檢測出山羊痘病毒，而不與同屬的綿羊痘病毒發(fā)生交叉反應。因此，本專利技術(shù)可快速特異性地從病料中或者培養(yǎng)的細胞毒中檢測出山羊痘病毒，從而判定是山羊痘病毒而不是綿羊痘病毒或別的病原體感染。而且本專利技術(shù)涉及的試劑盒最低可檢測出1.045X IO6個拷貝的模板，靈敏度高于同類能區(qū)分檢測出山羊痘病毒的分子生物學方法中的雙重PCR方法和PCR-RFLP方法，且不需要使用專門的PC本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
用于檢測山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于試劑盒中至少包括有四條引物，分別是SEQ?№1、SEQ?№2、SEQ?№3和SEQ?№4。
【技術(shù)特征摘要】
1.用于檢測山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于試劑盒中至少包括有四條引物，分別是SEQ Na 1、SEQ Na 2、SEQ Na 3 和 SEQ Na 4。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張強，趙志荀，范斌，吳國華，顏新敏，李健，朱海霞，蘆曉立，孫曉林，劉發(fā)央，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。