鑒別檢測(cè)綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開一種用于鑒別檢測(cè)綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)的鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒檢測(cè)盒內(nèi)包括有三組引物：SEQID№1、SEQID№2、SEQID№3、SEQID№4、SEQID№5、SEQID№6、SEQID№7、SEQID№8、SEQID№9、SEQID№10、SEQID№11和SEQID№12。本發(fā)明專利技術(shù)可快速鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒，并在羊痘病毒流行病學(xué)研究中應(yīng)用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種檢測(cè)試劑盒，確切講是一種用于檢測(cè)綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒。
技術(shù)介紹
羊痘(Capripox，CP)包括綿羊痘、山羊痘和牛的皮膚疙瘩病，其中前兩者是由綿羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)分別引起綿羊和山羊發(fā)生的接觸性傳染病。病畜體溫升高，全身出現(xiàn)丘疹或結(jié)節(jié)、水皰、內(nèi)臟病變甚至死亡，給世界養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其規(guī)定為法定必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病。綿羊痘和山羊痘的鑒別診斷一直是研究的熱點(diǎn)。研究表明，SPPV和GTPV基因序列同源性達(dá)到96%_97%，僅在基因組末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差異，見:Tulman，E.R.，Afonso,C.L，Lu, Z.，Zsakj L，Surj J.H.，Sandybaev, N.T.，Kerembekova, IL Z.，Zaitsev,V.L., Kutish，G.F., Rock, D.L., 2002.The genomes of sheeppox and goatpoxviruses.J Virol.76，6054-6061.。一般來說，SPPV、GTPV 具有較嚴(yán)格的宿主嗜性，但有一些研究表明試這兩種病毒也可發(fā)生宿主嗜性改變，引起交叉感染見:M.G.Garner,S.D.Sawarkar, E.K.Brett, J.R.Edwards, V.B.Kulkarni，D.B.Boyle; S.N.theExtent and Impact of Sheep Pox and Goat Pox in the State of Maharashtra, India，Tropical Animal Health and Production.2000，32 (4): 205-223.，繼而可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的臨床診斷和獲得不準(zhǔn)確的流行病學(xué)信息，不利于對(duì)該病的有效防控。對(duì)羊痘病毒分離株進(jìn)行準(zhǔn)確的種屬鑒別有助于解決生產(chǎn)中遇到的這個(gè)問題，但SPPV和GTPV之間抗原性具有明顯交叉，用血清學(xué)方法很 難區(qū)別開來，需通過分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒別，Sheeppoxand goatpox virus.World Organisation for Animal Health (2009).- TerrestrialAnimal Health Code.0IE，Paris.。準(zhǔn)確鑒定分離株種屬和弄清其來源將有助于羊痘的流行病學(xué)分析，具有重要意義。目前為止，基于基因序列分析的分子生物學(xué)鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒的方法并不十分成熟，前期本實(shí)驗(yàn)室通過克隆結(jié)合酶切的方法分析P32基因和GPCR基因建立了 PCR-RFLP 方法，而印度的 Gnanavel Venkatesanl 和 Madhusudan Hosamani等也分別建立了分析P32基因的PCR-RFLP，但是該方法需要專用的PCR儀器和酶切操作，相對(duì)來說比較繁瑣且費(fèi)用較多，不利于生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際應(yīng)用，見:顏新敏，吳國(guó)華，李健等.山羊痘病毒感染綿羊的診斷及其基因的分子分析.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41 (01):14.、Gnanavel Venkatesan, Vinayagamurthy Balamurugan, RevaniahYogisharadhya etal.，Differentiation of sheeppox and goatpox viruses bypolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.VIR0L0GICASINICA，2012，27(6):353-359.、Madhusudan Hosamani，Bimalendu Mondal，Prabhakar Aet al..Differentiation of Sheep Pox and Goat Poxviruses by Sequence Analysisand PCR-RFLP of P32 Gene, Virus Genes 29:1，73 - 80, 2004。而國(guó)內(nèi)肖雯[6]等建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR方法擴(kuò)增靈敏度僅為1.725 X IO7 copies/u L的SPPV和1.71X106 copies/u L的GTPV，且同樣需要專門的PCR儀器，因此該方法在生產(chǎn)實(shí)踐中也存在這局限性，肖雯，聶福平，王昱等.綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).2012，7(7):551-554.。環(huán)等溫介導(dǎo)技術(shù)(loopmediated isothermal amplication, LAMP)由于其具有快速、簡(jiǎn)便、無需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于各種疾病病原的檢測(cè)中。目前為止，美國(guó)科學(xué)家Amaresh Das等人建立了檢測(cè)羊痕病毒屬的Lamp方法,參見:Amaresh Das, Shawn Babiuk, and MichaelT.McIntosh.Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay forRapid Detection of Capripoxviruses.Journal of Clinical Microbiology.2012,1613 - 1620.。該研究靶向SPPV、GTPV和LSDV三種病原共有的保守的VP39基因，因此該方法并不能夠區(qū)分出綿羊痘病毒和山羊痘病毒；而國(guó)內(nèi)重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局李應(yīng)國(guó)等人也建立了檢測(cè)羊痘病毒屬的Lamp診斷試劑盒，參見:羊痘病毒屬病毒等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)用引物、試劑盒和檢測(cè)方法，專利號(hào):CN102373302A，該方法也是以SPPV、GTPV和LSDV三種病原共有的基因組1119272bp-120322bp保守序列為靶標(biāo)基因。因此，他們所建立的方法或者試劑盒僅僅能檢測(cè)出羊痘病毒屬病毒，而不能夠區(qū)別出同屬不同種的病毒，即不能夠區(qū)分綿羊痘病毒和山羊痘病毒。同時(shí)這些方法同樣存在的檢測(cè)靈敏度較低的不足，這對(duì)病毒檢測(cè)是不利的。尋找一種可以鑒別診斷綿羊痘病毒和山羊痘病毒試劑盒和檢測(cè)方法，特別是找到一種可以有更高檢測(cè)靈敏度的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，對(duì)羊痘病的診斷、治療與預(yù)防有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供一種可以克服現(xiàn)有技術(shù)不足，能聯(lián)合鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒的檢測(cè)試劑盒，特別是提供一種可比現(xiàn)有技術(shù)有更高檢測(cè)靈敏度或更廉價(jià)方便的檢測(cè)試劑盒。本專利技術(shù)的鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒檢測(cè)盒內(nèi)包括有三組引物:SEQ ID Ns 1、SEQ ID Na 2、SEQ ID Na 3、SEQ ID Na 4、SEQ ID Na 5、SEQ ID Na 6、SEQ ID Na 7、SEQ IDNa 8、SEQ ID Na 9、SEQ ID Na 10、SEQ ID Ns 11 和 SEQ ID Na 12。本專利技術(shù)的六對(duì)序列分別為: 可特異性擴(kuò)增山羊痘病毒核酸的引物:SEQ ID Ns 1:ACCAAAACAAATAATCAGAGATG，在本專利技術(shù)中本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
鑒別檢測(cè)綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于檢測(cè)盒內(nèi)包括有三組引物：SEQ?ID?№1、SEQ?ID?№2、SEQ?ID?№3、SEQ?ID?№4、SEQ?ID?№5、SEQ?ID?№6、SEQ?ID?№7、?SEQ?ID?№8、SEQ?ID?№9、SEQ?ID?№10、SEQ?ID?№11和SEQ?ID?№12。

【技術(shù)特征摘要】
1.鑒別檢測(cè)綿羊痘病毒和山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于檢測(cè)盒內(nèi)包括有三組引物:SEQ ID Na U SEQ ID Na 2、SEQ ID Na 3、SEQ ID Na 4、SEQ ID Na 5、SEQ ID Na 6、SEQID Na 7、SEQ ID Na 8、SEQ ID Na 9、SE...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙志荀，張強(qiáng)，范斌，吳國(guó)華，顏新敏，李健，朱海霞，蘆曉立，孫曉林，劉發(fā)央，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：