制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒與方法技術

本發明專利技術公開了一種制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒以及擴增HIV抗原特異性CTL的方法。本發明專利技術使用促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑刺激培養去除了Tregs細胞的艾滋病患者外周血單個核細胞，獲得了大量的HIV抗原特異性CTL。本發明專利技術的方法大大提高了HIV抗原特異性CTL的擴增效率同時增強了HIV抗原特異性CTL的殺傷功能。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及免疫細胞
，主要涉及制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒與方法。
技術介紹
艾滋病是一種嚴重危害人類健康的致死性傳染病，我國自1985年發現第1例艾滋病病毒(HIV)感染者以來，新感染人數每年快速增長，并以驚人的速度從高危人群向一般人群擴散。HIV(Human immunodeficiency virus)感染最主要的特征是其能夠直接感染和破壞人體免疫系統，導致CD4+T細胞數量不斷減少，最終導致感染者免疫系統崩潰而死亡。細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)，是效應T細胞，可特異性識別MHC分子提呈的抗原，進而特異性地殺傷腫瘤細胞及受微生物感染的細胞等。CTL可高效且特異地殺傷靶細胞，而不損害正常組織。CTL殺傷腫瘤細胞的機制包括：1)釋放顆粒酶和穿孔素直接誘導腫瘤細胞死亡；2)通過Fas/FasL途徑誘導腫瘤細胞凋亡；3)分泌IFN-γ和TNF-α等細胞因子殺傷腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞生長。細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對HIV病毒具有殺傷功能。通過進一步對患者疾病進展不同階段抗原特異性CTL細胞數量、頻率的監測，發現其數量和頻率的變化與病毒清除的效率密切相關。因此建立高效的CTL細胞的擴增方法，對于研究HIV清除的免疫機制、有效評判臨床預后具有重要意義。為了解決CTL細胞擴增效率低下的問題，本專利技術提供了一種剔除調節性T淋巴細胞(T regulatory cells,Tregs)進行CTL細胞體外擴增的方法。專利技術通過將艾滋病患者的外周血中Tregs去除，并聯合細胞因子IL-2添加的方式有效擴增CTL細胞。此方法能有效提高CTL細胞擴增的效率，對于研究HIV清除的免疫機制具有更為重要的意義。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種HIV抗原特異性CTL的擴增方法。本專利技術通過將艾滋病患者的外周血中Tregs去除，并聯合細胞因子IL-2添加的方式有效擴增HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞。大大增強HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的殺傷功能。為了實現上述目的，本專利技術采取了如下技術方案：本專利技術提供了一種擴增HIV抗原特異性CTL的方法，所述方法包括以下步驟：(1)分離并體外培養艾滋病患者外周血單個核細胞；(2)去除單個核細胞內的Tregs細胞；(3)使用促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑刺激培養經過步驟(2)處理的細胞。進一步，本專利技術選擇的艾滋病患者其HIV血清學標志物為HIV Ab+，白細胞抗原標志物為HLA-A2+。其中上角標的正(+)負(-)分別表示陽性和陰性。通常采用PBMC作為CTL的起始細胞的來源，PBMC中含有CD4陽性T淋巴細胞(CD4+T)、CD8陽性T淋巴細胞(CD8+T)、B淋巴細胞、單核細胞(Mo)、自然殺傷細胞(NK)等多種細胞成份。采用單采法一次性可采集大量外周PBMC，獲得大量起始細胞，多余PBMC可輻照或凍存，用于多次細胞毒性T淋巴細胞制備和應用，且方法操作簡便。進一步，外周血單個核細胞的分離方法包括但不限于，葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)，用此方法分離PBMC純度可達95％，淋巴細胞約占90％，其中T淋巴細胞占80％，B淋巴細胞占4～10％。進一步，葡聚糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合溶液，又稱淋巴細胞分層液，在分離人PBMC時，要求其比重為1.077±0.01。作為可替代的實施方案，葡聚糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合溶液可被percoll細胞分離液代替。進一步，步驟(2)中剔除的步驟(1)獲取的單個核細胞內的Tregs細胞是細胞表面標記為CD4+CD25+CD127-的調節性T細胞。進一步，步驟(2)中剔除步驟(1)獲取的單個核細胞內的Tregs細胞可采用免疫磁珠陰性分選法。免疫磁珠分離法是基于細胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單克隆抗體相結合，在外磁場作用下，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面標記抗原的細胞由于不能與磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，因此不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。免疫磁珠分離法有陽性分選法和陰性分選法，陽性分選法的磁珠所結合的細胞是需要分離獲得的細胞，而陰性分離法的磁珠所結合的細胞為不需要細胞。本專利技術利用免疫磁珠陰性分選法將PBMC中的Treg細胞去除，將PBMC向Treg轉化降至最低，PBMC中剩下的細胞則進行后續的HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞誘導擴增培養。進一步，步驟(3)中添加的促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑包括但不限于IFN-γ、IL-1α、PHA、IL-2、IL-7中的一種或者幾種。優選地，本專利技術采用的促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑為IL-2。本專利技術還提供了一種制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包括：分離外周血單個核細胞的試劑；淋巴細胞分離液；促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑。進一步，所述淋巴細胞分離液包括葡聚糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合溶液，或percoll細胞分離液。進一步，所述促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑包括但不限于IFN-γ、IL-1α、PHA、IL-2、IL-7中的一種或者幾種。優選地，本專利技術采用的促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑為IL-2。本專利技術的試劑盒還可以包括：PBS緩沖液；10％胎牛血清培養基。本專利技術還提供了一種HIV抗原特異性CTL的檢測方法，所述檢測方法包括通過流式細胞儀檢測HIV抗原特異性CTL的頻率。抗原特異性CTL流式檢測所用的免疫球蛋白五聚體(Pentamer)識別的HIV抗原表位是p17gag蛋白上的SL9(SL9,SLYNTVAL)表位。Pentamer由北京四正柏生物科技有限公司提供。本專利技術的優點和有益效果：(1)本專利技術選用剔除Tregs細胞，聯合細胞因子IL-2的方式刺激HIV抗原特異性CTL，有效地提高了HIV抗原特異性CTL的擴增效率。(2)本專利技術選用MHC肽五聚體染色的技術檢測HIV抗原特異性CTL，通過Pentamer染色可以有效區分HIV抗原特異性CTL的擴增效率。附圖說明圖1顯示利用流式細胞儀檢測HIV抗原特異性CTL的擴增效率；A：陰性對照，B：PBMC+IL-2；C：PBMC-Tregs+IL-2。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本專利技術，僅用于解釋本專利技術，而不能理解為對本專利技術的限制。本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本專利技術的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本專利技術的范圍由權利要求及其等同物限定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件實施檢測。實施例1外周血單個核細胞分離1、材料收集：收集解放軍第302醫院艾滋病患者的血液1份，其血清學標志物為HIV Ab+，白細胞抗原標志物為HLA-A2+，符合上述檢測標準的樣本進行后續實驗。2、外周血單個核細胞分離(1)靜脈取血20ml，加入含肝素溶液(10～50U/m1血樣本)的試管中，混勻，使血液抗凝本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：分離外周血單個核細胞的試劑；淋巴細胞分離液；促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑。

【技術特征摘要】
1.一種制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：分離外周血單個核細胞的試劑；淋巴細胞分離液；促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑。2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑是IL-2。3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：PBS緩沖液；10％胎牛血清培養基。4.一種擴增HIV抗原特異性CTL的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(1)分離并體外培養艾滋病患者外周血單個核細胞；(2)去除單個核細胞內的Tregs細胞；(3)使用促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑刺激培養經過步驟(2)處理的細胞。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，去...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王福生，徐若男，張紀元，金磊，施明，
申請(專利權)人：王福生，
類型：發明
國別省市：北京;11