特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種EphA2來源的抗腫瘤CTL表位肽，為九肽，其氨基酸序列為Gln?Asn?Ile?Met?Asn?Asp?Met?Pro?Ile。本發(fā)明專利技術(shù)還包括上述肽在制備腫瘤治療性DC?CIK中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)所制備的特異性的DC?CIK細胞對肝癌細胞HepG2顯示出一定的殺傷率，可用于制備肝癌特異性自體免疫細胞的制備。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及表位肽
，尤其涉及一種特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽及其應(yīng)用，還涉及一種腫瘤抗原EphA2特異性DC細胞的制備方法及其應(yīng)用，以及一種腫瘤抗原EphA2特異性DC-CIK細胞的制備方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
Eph(erythropoietin producing human hepatocellularcarcinoma)受體家族是受體酪氨酸激酶(RTKs)家族成員中最大的亞族，Eph受體和其配體ephrins間的相互作用參與了胚胎發(fā)育的許多過程，如在神經(jīng)軸突導向﹑血管發(fā)生﹑腫瘤形成等方面具有重要作用。EphA2是EphA亞家族受體8個成員中的第2個，與Eph受體家族的其他成員有著相似的結(jié)構(gòu)特征，并且與細胞增殖﹑遷移等有關(guān)。EphA2在正常成熟細胞尤其是上皮細胞中處于低表達狀態(tài)，而在一些惡性腫瘤中廣泛高表達，如肝癌、食管癌、前列腺癌、侵襲性黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌等等。目前治療癌癥主要有外科療法(手術(shù))、化學療法(化療)、放射治療(放療)和生物治療四大模式，外加傳統(tǒng)的中醫(yī)藥治療和現(xiàn)代微創(chuàng)治療方法。但是大多數(shù)病人的經(jīng)過治療后的生存率和生活質(zhì)量均沒有得到很大改善。這可能由于腫瘤在發(fā)生的早期就有部分腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到其他組織或器官，而目前的檢查手段并不能顯示出來，這很可能是很多腫瘤在治療后，出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因。因此腫瘤的治療需要作為全身性疾病進行治療，不僅要去除局部病灶的腫瘤，還要防止腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移。才可能真正有效地提高腫瘤病人的治愈率和生存期。傳統(tǒng)的化療藥物雖然在某些腫瘤的治療方面取得一定的進展，但是患者的5年生存率來看，并沒有明顯改善，同時化療藥物容易出現(xiàn)獲得性多耐藥及毒副作用，限制其臨床使用，因此需要更好的全身治療的手段。免疫細胞治療是近二十年發(fā)展起來的，指的是刺激人體自身免疫系統(tǒng)來抵抗癌癥的治療方法。腫瘤免疫治療有望成為繼手術(shù)、化療、放療、靶向治療后腫瘤治療領(lǐng)域的一場革新。相比于傳統(tǒng)的治療方法表現(xiàn)出更好的靶向性和特異性，對腫瘤的治療更為有效，無毒副作用，對提高生命質(zhì)量、延長生存期有顯著地效果，是目前腫瘤全身治療的最佳手段之一。然而，目前在誘導特異DC-CIK細胞的抗原仍有待改進，缺乏能夠高效刺激腫瘤特異性DC-CIK的CTL表位多肽抗原。
技術(shù)實現(xiàn)思路
基于
技術(shù)介紹
存在的技術(shù)問題，本專利技術(shù)目的在于提供一種特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽。本專利技術(shù)目的還在于提供上述特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽的應(yīng)用。本專利技術(shù)目的還在于提供一種腫瘤抗原EphA2特異性DC細胞的制備方法。本專利技術(shù)目的還在于提供一種腫瘤抗原EphA2特異性DC-CIK細胞的制備方法。本專利技術(shù)目的還在于提供上述腫瘤抗原EphA2特異性DC細胞和DC-CIK細胞的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采取如下技術(shù)方案：本專利技術(shù)提出的一種特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽，所述CTL識別表位肽為九肽，其氨基酸序列如下：Gln-Asn-Ile-Met-Asn-Asp-Met-Pro-Ile。上述特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽采用固相合成法進行合成。基本流程如下：首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上；其次將第二個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的肽，再經(jīng)HPLC純化，其純度大于90％。本專利技術(shù)還提出的上述特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽在制備具有EphA2表達的腫瘤治療性多肽疫苗的應(yīng)用。優(yōu)選地，上述特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽在制備肝癌EphA2表達相關(guān)的腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用，尤其對肝癌細胞HepG2具有殺傷力。本專利技術(shù)還提出的一種腫瘤抗原EphA2特異性DC細胞的制備方法，采用上述特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽加入DC細胞進行培養(yǎng)得到。本專利技術(shù)還提出的上述腫瘤抗原EphA2特異性DC細胞的制備方法得到的特異性DC細胞在制備治療EphA2表達相關(guān)的腫瘤藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)還提出的一種腫瘤抗原EphA2特異性DC-CIK細胞的制備方法，采用上述特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽進行誘導得到。本專利技術(shù)還提出的上述腫瘤抗原EphA2特異性DC-CIK細胞的制備方法得到的特異性DC-CIK細胞在制備治療EphA2表達相關(guān)的腫瘤藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)巧妙利用EphA2在肝癌等腫瘤中呈現(xiàn)高表達，而在正常組織中表達很低，從而采用理論和實驗相結(jié)合的方法篩選得到腫瘤相關(guān)抗原的表位肽，所得表位肽未見文獻報道，為研制基于抗原EphA2的腫瘤疫苗或腫瘤特異性CTL細胞的制備提供理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)多價的抗原肽疫苗構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1為本專利技術(shù)提出的一種特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽的質(zhì)譜分析圖。圖2為本專利技術(shù)實施例1所得P1、P2、P3……P20各自誘導得到的特異性CTL細胞分泌INF-γ的能力對比圖。圖3為本專利技術(shù)實施例1所得P5、P8、P11、P13各自誘導得到的特異性CTL細胞對肝癌細胞HepG2殺傷能力對比圖。圖4為由本專利技術(shù)提出的一種特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽所制備得到的特異性CTL細胞免疫細胞群的流式細胞儀檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析圖。具體實施方式下面，通過具體實施例對本專利技術(shù)的技術(shù)方案進行詳細說明。實施例1：合成表位肽采用理論與實踐相結(jié)合的方法，根據(jù)抗原的一級結(jié)構(gòu)，綜合運用免疫信息學手段，運用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、WAPP和EpiJen綜合對EphA2的抗原CTL表位進行預測分析，選取評分前20的多肽序列進行試驗篩選，一次命名為P1、P2、P3……P20。基本流程如下：首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上；其次將第二個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的表位肽粗品。將目的表位肽粗品經(jīng)HPLC純化得到目的表位肽精肽，其純度大于90％，質(zhì)譜分析證實其分子量符合理論值。本專利技術(shù)提出的一種特異性腫瘤抗原EPHA2的CTL識別表位肽采用Fmoc固相合成法進行合成，所述CTL識別表位肽為九肽，編號為P8，其氨基酸序列如下：Gln-Asn-Ile-Met-Asn-Asp-Met-Pro-Ile。對P8進行質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜分析結(jié)果如圖1所示，可以證實其分子量為1075.25976g/mol，符合理論值。實施例2：多肽功能檢測上述所得P8和其余19個表位肽，可用于制備具有EphA2表達的腫瘤治療性多肽疫苗，其應(yīng)用實驗如下：1、上述CTL識別表位肽誘導特異性CTL細胞、IFN-γ分泌及對腫瘤靶細胞的殺傷實驗檢測：本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽，其特征在于，所述CTL識別表位肽為九肽，其氨基酸序列為Gln?Asn?Ile?Met?Asn?Asp?Met?Pro?Ile。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽，其特征在于，所述CTL識別表位肽為九肽，其氨基酸序列為Gln-Asn-Ile-Met-Asn-Asp-Met-Pro-Ile。2.權(quán)利要求1所述特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽在制備具有EphA2表達的腫瘤治療性多肽疫苗的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述特異性腫瘤抗原EphA2的CTL識別表位肽在制備肝癌EphA2表達相關(guān)的腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。4.一種腫瘤抗原EphA2特異性DC細胞的制備方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1所述特...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：唐奇，馮振卿，許國貞，劉振云，蒯興旺，朱進，章明炯，
申請(專利權(quán))人：安徽未名細胞治療有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：安徽;34